鱼腥草破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药饮片的质量检测方法，尤其是鱼腥草破壁饮片的HPLC指纹标准 图谱构建及其质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜HouttuyniacordataThunb?的新鲜全草或干 燥地上部分。有效成分主要是挥发油、黄酮类和苯丙素类物质。挥发油中功能性成分为醛 酮化合物，主要是癸酰乙醛及月桂醛，两者均有鱼腥草特异气味。黄酮类物质主要是槲皮 素、槲皮苷、异槲皮素、金丝桃苷、阿夫苷、瑞诺苷和芸香苷。目前鱼腥草的质量控制研宄也 比较多，主要的研宄方法有：1、以挥发油或总黄酮为指标控制质量标准。2、以GC - MS指纹 图谱来控制鱼腥草挥发油成分的质量，以HPLC - DAD-MS指纹图谱控制鱼腥草非挥发性成 分质量，两者结合可较全面地控制鱼腥草及其制剂的质量。3、以指纹图谱结合一测多评模 式控制鱼腥草质量。以何兵，刘艳等在《指纹图谱结合一测多评模式在中药鱼腥草质量评价 中的应用研宄》中记载的方法为代表。但在实际操作中，鱼腥草的挥发油类成份不稳定，易 氧化聚合失效，在干制或不当提取过程中，其有效成分会发生较大的质和量的变化，直接影 响到药物的疗效，而黄酮、绿原酸及总的浸出物不具有专属性，也未能系统，完整的反映该 药的内在质量，因而不能有效的控制样品的临床疗效。故目前的技术方法均不完善。
[0003] 中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45 y m的微细颗粒，再制成30~100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致， 质量均一，稳定性好的特点，为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形 态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、 质量检测方法不能完全适用。发明人参照何兵，刘艳等《指纹图谱结合一测多评模式在中药 鱼腥草质量评价中的应用研宄》的方法对鱼腥草破壁饮片进行检测，但效果并不理想，此文 献的方法并不适用特殊的破细胞壁饮片。此文献的方法难以将鱼腥草破壁饮片HPLC全谱 中的主成分峰分离开，因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片 质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对照品的选 择和供试品的制备方法等均需要研宄考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中药指纹图 谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定性、重现 性和精密度差缺陷，不能完全反应饮片的质量情况的缺陷。
【发明内容】
[0004] 为克服以上缺陷，本发明提供了一种适用于鱼腥草破壁饮片的HPLC指纹标准图 谱构建方法，并在此基础上进一步提供该饮片的质量检测方法。
[0005] 所述的鱼腥草破壁饮片的标准图谱构建方法包括以下步骤：
[0006] (1)供试品溶液的制备：精确称取鱼腥草破壁饮片样品约0. 500g，加入90%的甲 醇25ml，浸润30min,超声提取30min，用0. 22um微孔滤膜过滤备用；
[0007] ⑵对照品溶液配制：精密称取槲皮苷对照品适量，加90%甲醇配制成约0. 16mg/ ml对照品溶液；（3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色 谱柱，柱温30°C，流速1. 2ml/min，检测波长326nm，流动相A为乙腈，B为0. 1 %的磷酸溶液； 梯度洗脱：〇min-45min，乙腈变化为10% -27%，进样量10ul。
[0008] (4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法和色谱条件对10批以上的鱼腥草破 壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以槲皮苷峰为参照峰，计算各指纹图谱中 主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图 谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立鱼腥草破壁饮片指纹图谱共 有模式标准图谱如图3所示，包括7个特征峰。
[0009] 鱼腥草破壁饮片的质量检测方法，包括以下步骤：
[0010] (1)按上述标准图谱构建方法中步骤（1)和步骤（2)分别制备待测样品供试品溶 液和对照品溶液，按步骤（3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品及对照品溶液各10ul， 注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。
[0011] (2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法
[0012] 供试品色谱中，应呈现7个与图3-鱼腥草破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对 应的特征峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱 的相似度不得低于0.95。以槲皮苷峰为对照峰，其余6个共有特征峰相对保留时间分别为： 0? 196、0. 300、0. 337、0. 761、0. 788、0. 817,各峰相对保留时间 RSD 彡 ±5%，为合格品。
[0013] 本发明是首次针对鱼腥草破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标 准图谱及质量检测方法。该方法克服了现有技术不能完全适用鱼腥草破壁饮片质量控制的 缺陷。该图谱较全面涵盖了鱼腥草饮片主要活性成分的图谱信息，专属性明显优于现有的 同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作 简单，检测快速准确；并能有效控制鱼腥草药材、破壁粉体、破壁饮片整体质量及鉴别伪品。
【附图说明】
[0014] 图1是鱼腥草破壁饮片预实验比较图谱。
[0015] 图2是鱼腥草破壁饮片指纹图谱专属性考察图谱。
[0016] 图3是鱼腥草破壁饮片共有模式指纹图谱。
[0017] 图4鱼腥草20140301批次原药材-中间体-成品相关性图谱。
[0018] 图5是鱼腥草20140302批次原药材-中间体-成品相关性图谱。
[0019] 图6是鱼腥草021408P081批次原药材-中间体-成品相关性图谱。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 1仪器与试样
[0022] 1. 1仪器：电热重蒸馏水器（上海三申医疗器械有限公司）、电热恒温水浴 锅HWS24(上海一恒科技有限公司、FEJ-200电子称（d = 0. lg)、万分之一电子天平 AB204-S(METTLERT0LE0D)、十万分之一电子天平AUW220D(岛津公司）安捷伦1200RLC快 速液相色谱仪（配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元 泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机G1316B柱温箱，Agilent Chemstation色谱工作站、 Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)、Agilent Z0RBAX-C18 1.8 ym(50mmX4. 6mm)、 菲罗门 PhenomenexSynergi 4u Fusion-RP 80A(250mmX4.6mm)色谱柱、KQ-400K0E 型高功 率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
[0023] 1. 2试剂：乙腈（色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）、甲醇（色谱纯，安徽 时联特种溶剂股份有限公司）、磷酸（广州化学试剂厂），甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）、 重蒸水（自制）。
[0024] 供试品：鱼腥草破壁饮片、破壁粉体及原药材（均由中山中智药业集团提供）
[0025] 对照品：槲皮苷对照品（111538-200504)、异槲皮苷对照品（111809-201001)、金 丝桃苷对照品（111521-201004)、芦丁对照品（100080-200707)、绿原酸（110753-201314)， 均由中国食品药品检定研宄院提供。
[0026] 2实验方法
[0027] 2. 1鱼腥草破壁饮片预实验
[0028] 样品制备：精确称取鱼腥草破壁饮片（批号20120702) 0. 5016g于50ml具 塞锥形瓶中，加入90%甲醇25ml，称定重量，浸润30min，超声提取（功率320w，频率 4200KHZ) 30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，0. 22um微孔 滤膜过滤备用。
[0029]色谱条件 1 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色谱柱，柱温 30°C，流速 lml/min，流动相乙腈-〇? 1 %磷酸，梯度洗脱：0min-10min-35min-37min-40min,乙腈百分 比变化为：6% -8% -27% -6% -6% ;检测波长254nm, 326nm,进样量10ul。（命名为参考 文献5)。
[0030]色谱条件 2 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色谱柱，柱温 30°C，流速 lml/min，流动相乙腈-水，梯度洗脱：0min-60min,乙腈百分比变化为：5% -100% ;检测波 长210nm、254nm、280nm、325nm,进样量10ul。（命名为基础梯度）。
[0031]色谱条件 3 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色谱柱，柱温 30°C，流速 lml/min，流动相乙腈-0. 1%磷酸，梯度洗脱：0min-60min,乙腈百分比变化为：5% -100%; 检测波长21〇11111、25411111、28〇11111、32511111，进样量1〇111。（命名为基础梯度+01磷酸） 。
[0032]色谱条件 4 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色谱柱，柱温 20°C，流速 lml/min，流动相甲醇一0. 1 %磷酸，梯度洗脱0min-40min-50min-60min-70min,甲醇百分 比变化为：1〇% -20% -30% -10% -10% ;检测波长320nm、325nm,进样量20ul。（命名为 参考文献2)。
[0033]色谱条件 5 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色谱柱，柱温 20°C，流速 lml/min，流动相甲醇一0? 1 %磷酸，梯度洗脱 0min-5min-10min-20min-30min-35min-50m in,甲醇百分比变化为：30% -30% -55% -55% -95% -100% ;检测波长 280nm、320nm,进 样量20ul。（命名为参考文献