构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于NPCO/CO304-AU/RUSi@RU(bpy)32+构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器的制备方法及应用。具体涉及一种RuS1Ru (bpy) 32+作为发光材料，纳米复合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+作为捕获抗体基底的电致化学发光传感器的制备与应用，属于电致化学发光检测技术领域。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是广泛存在于自然界的农产品污染物，真菌毒素具有强烈的肾脏毒性，肝脏毒性和神经毒性，并且有致畸、致癌和致突变作用。真菌毒素的存在对人类和动物健康以及畜牧业发展构成了巨大的威胁。激素是由人和动物某些细胞合成和分泌、能调节机体生理活动的特殊物质，和神经系统一起调节人体的代谢和生理功能。正常情况下各种激素是保持平衡的，如因某种原因使这种平衡打破了这就造成内分泌失调，会引起相应的临床表现。因此，可利用测定真菌毒素和激素的含量来判断农产品污染状况及疾病诊断。
[0003]目前真菌毒素和激素的检测方法主要是色谱分析和免疫分析法，例如薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法。虽然色谱分析灵敏度很高，但是色谱分析需要繁琐的样品预处理、预富集、仪器操作步骤复杂等缺点。为了克服以上色谱分析方法的缺点，本发明设计了一种简单、快速、灵敏度和选择性高的电致化学发光免疫分析方法。
[0004]本发明利用RuS1Ru (bpy) 32+为电致化学发光信号源，RuS1Ru (bpy) 32+通过共价键固载在NPCo/Co304-Au表面制得抗体捕获基底，利用NPCo/Co304-Au优良的生物兼容性和大的比表面积将抗体固载在纳米复合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+表面。在本发明中制备的电致化学发光传感器具有操作简单，成本低，灵敏度高，特异性高等优点，克服了传统色谱分析的很多不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有的真菌毒素和激素检测方法存在的问题，提供一种简单快速可靠的基于NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+构建的电致化学发光传感器的制备方法和应用，实现对真菌毒素和激素的灵敏、特异、快速、高效检测。
[0006]本发明的技术方案如下:
1.一种基于NPCO/CO304-AU/RUSi@RU(bpy)32+构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6 μ L、0.5-2 mg ml/1 的待测物抗体孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液于电极表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、质量分数为1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用PH6.4-8.4的PBS溶液冲洗电极表面，4°C晾干，制得一种基于NPCo/Co304-Au/RuSiiRu (bpy) 32+构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器。
[0007]2.待测物抗体孵化物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)327Ab溶液的制备
(1)NPCo/Co304-Au 的制备
将CoAl合金置入过量的0.5?1.5 mo I/L的氢氧化钠溶液中，在室温下腐蚀32?74h，离心洗涤至中性，在室温下干燥12?48 h，制得纳米多孔Co/Co304纳米材料，即NPCo/Co3O4;
将80?120 mL，质量分数为0.005?0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2?3 mL，质量分数为0.5?1.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10?20 min，溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到金纳米粒子，4°C下避光保存；
将I?3 mg的NPCo/Co304分散到I mL超纯水中，加入0.5?L 5 mL金纳米粒子，得到的混合溶液在室温下振荡12?32 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，制得NPCo/Co3O4-Au,将NPCo/Co304-Au重新分散到I mL超纯水中，制得NPCo/Co304_Au溶液；
(2)RuSiiRu(bpy)32+的制备
将 330 ?350 yL、35 ?45 mmol/L Ru (bpy) 32+和 1.77 mL 聚乙二醇辛基苯基醚、7.5mL环己烷以及1.8 mL正己醇共混，混合液磁力搅拌25?35min，形成油包水微乳液，加入100 y L四乙基原硅酸钠和60 μ L氨水，搅拌24 h，加入丙酮破坏微乳剂，离心并用乙醇和超纯水洗涤，得到橙色的RuSi NPs ;加入体积分数为10%的氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，搅拌2 h，得到氨基化的RuSi NPs,离心并重新分散到500 μ L、pH 6.4?8.4的PBS溶液中，加入9?11 μ L、质量分数为1%的Ru (bpy) 32+和10 μ L、质量分数为1%的羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌24 h，离心，用pH 6.4?8.4的PBS溶液洗涤所得的RuS1Ru (bpy) 32+，除去过量的Ru (bpy) 32+和羟基琥珀酰亚胺，并重新分散到500 μ L、pH 6.4?8.4PBS溶液中，制得 RuS1Ru (bpy) 32+溶液；
(3)纳米复合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+溶液的制备
将80?120 UL的RuS1Ru (bpy) 32+溶液加入到(I)制得的NPCo/Co 304_Au溶液中，室温下振荡12?32 h，离心，将得到的产物分散到pH6.4?8.4的PBS溶液中，制得纳米复合物 NPCo/Co304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+溶液；
(4)待测物抗体孵化物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)327Ab溶液的制备
在纳米复合物 NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+溶液中，加入 10 ?100 μ L、1 mg/mL 的待测物抗体Ab溶液，在4°C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab，将产物分散到I mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得待测物抗体孵化物NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液，储存在4 °0下备用。
[0008]3.真菌毒素类和激素类待测物的检测，检测步骤如下:
(1)滴加6μ L待测物标准溶液于所制备的电致化学发光传感器表面，用pH 6.4-8.4的PBS溶液冲洗表面，放置在4°C的冰箱中孵化3~12 h，晾干；
(2)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电致化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为500 V，单介脉冲循环伏安法的脉冲电压，脉冲时间，起始电压和脉冲周期分别为-1.5 V、0.45 s、-0.95 V和7 s; (3)在10mL、pH 5.7-7.7的含25~45 mmol/L过硫酸钾的PBS溶液中，通过电致化学发光系统，检测对不同浓度的待测物标准溶液产生的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线；
(4)将待测物样品溶液代替待测物标准溶液进行检测。
[0009]所述待测物为真菌毒素类或激素类；真菌毒素类选自下列之一:黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、杂色曲霉素、展青霉素；激素类选自下列之一:地塞米松、炔诺酮、19-去甲睾酮、玉米赤霉醇、群勃龙、醋酸甲羟孕酮、雌二醇。
[0010]本发明的有益成果
(I)电致化学发光传感器制备方法，以RuS1Ru (bpy) 32+为发光材料，利用RuS1Ru (bpy) 32+良好的光学性能，构建的传感器具有更高的灵敏度；
(2 ) RuSiiRu (bpy) 32+通过共价键与NPCo/Co 304_Au结合作为抗体捕获基底，利用NPCo/Co304-Au优良的生物兼容性和大的比表面积将抗体有效地固载在纳米复合物NPCo/Co3O4-Au/ RuS1Ru (bpy) 32+表面；
(3)本发明制备的电致化学发光传感器用于真菌毒素和激素的检测，操作简单，响应时间短，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
[0011]实施例1一种基于NPCo/Co 304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6 μ L、0.5 mg ml/1 的待测物抗体孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液于电极表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 6.4的PBS溶液冲洗电极表面，4°C晾干，制得一种基于NPCO/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器。
[0012]实施例2—种基于NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+构建的真菌毒素类和激素类电致化学发光传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化铝抛光粉做抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6 μ L、I mg mL—1 的待测物抗体孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab 溶液于电极表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的PBS