一种家蚕成品卵微孢子虫病光激化学发光免疫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体设及一种家蚕成品卵微抱子虫病光激化学发 光免疫检测方法。
【背景技术】
[0002] 家蚕微抱子虫（Nosemabombycis，Nb)侵染家蚕引发的微粒子病是家蚕的毁灭性 传染病，被确定为世界养蚕地区惟一的检疫病害。近年来国内外学者在家蚕微粒子病的检 测方面开展了大量研究工作，取得较大进展，但由于成本、实际灵敏度、操作的复杂性等方 面的影响，至今未能有一种技术能够取代现行的光学显微镜检测法。AlphaLISA技术是一种 基于微珠的化学发光的新型均相检测技术，AlphaLISA的检测原理类似于双抗夹心法，主要 依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用，当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接 近时，激光激发级联反应，从而产生极大放大的信号，进而被检测到。
[0003] 近年来，该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的应用，但针对家蚕微 抱子虫的AlphaLISA检测试剂盒，目前国内外均未见报道。与传统的ELISA技术相比， AlphaLISA检测试剂盒具有更高的敏感性、精确性、均一性、背景低、广泛的动态检测范围， 而且无需洗漆及样本需求量极少等特点。该技术已在医学及分子生物学领域得到了广泛的 应用。但是，针对家蚕微抱子虫AlphaLISA检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种家蚕成品卵微抱子虫病 光激化学发光免疫检测方法。
[0005] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种家蚕成品卵微抱子虫病光激化学 发光免疫检测方法，包括如下步骤：
[0006] 1)家蚕微抱子虫抱壁蛋白抗原的制备；先将微抱子虫的抱子用玻璃珠破碎12~ 13小时后，进行DAPI染色观察，并进行筛选，视野里没有看到发出藍光的抱子核，通过观察 多个视野统计，所制备抱壳的纯度为99 %W上，得到微抱子虫抱壳；然后，将所述微抱子虫 抱壳再用玻璃珠破碎12~13小时，得到抱壳碎片蛋白，即家蚕微抱子虫抱壁蛋白抗原；
[0007] 2)鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立；W步骤1)制得 的抱壳碎片蛋白为抗原，免疫BALB/C小鼠，采用PEG1500细胞融合技术，并经过亚克隆筛 选，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0008] 3)家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体的腹水制备及纯化；复苏步骤2)制得的家 蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，腹腔注射BALB/C小 鼠，收集腹水，并采用辛酸-硫酸锭法进行抗体的纯化；将纯化的家蚕微抱子虫抱壁蛋白单 克隆抗体分为两份，一份用生物素标记，另一份与受体微球偶联；
[0009] 4)家蚕微抱子虫AlphaLISA检测方法的建立：采用双抗体夹屯、法检测微抱子虫；
[0010] ①家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体与生物素连接；取步骤3)制备的纯化抗体 Img加入带有滤膜的离屯、管中，W9000r/min离屯、8min;用标记缓冲液（0.Imol/LNagCOg/NaHC〇3, pH9.5)重复洗漆6次；收集抗体，配制成50yL的抗体溶液，所述抗体溶液中包括家 蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体、标记缓冲液和5yL22mg/mL的生物素（用DMS0配制）； 将所述抗体溶液于室温振动解育化，利用带有滤膜的离屯、管去除多余生物素，得到生物素 化抗体，并将生物素化抗体用IxAphaLISA缓冲溶液调整浓度为0. 5mg/mL;
[0011] ②家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体与受体微球偶联；取步骤3)制备的纯化 抗体0. 2mg加入带有滤膜的离屯、管中，W9000r/min离屯、8min，用缓冲液（；0. 13mol/L， pH8.0PB巧重复洗漆6次后收集抗体，在抗体溶液中加入Img受体微球、lOyL25mg/ mLNaB&CN(用PBS缓冲液配制，现配现用）、1. 25yL质量浓度为10%的Tween-20,而后用 缓冲液将总体积补充到200yL，于37°C避光振荡反应4她；最后加入10yL65mg/mL駿甲 基哲胺盐酸盐溶液（用0. 8mol/L化OH配制，现配现用），于37°C避光解育比封闭未结合 位点，离屯、洗漆，得到已连接抗体的受体微球，用IxAphaLISA缓冲液调整受体微球浓度为 5mg/mL；
[0012] ⑨方法的建立；将步骤②制得的已连接抗体的受体微球与IxAphaLISA缓冲液按 照1:50~1:100的体积比进行稀释，步骤①制得的生物素化抗体与IxAphaLISA缓冲液按 照1:200~1:400的体积比进行稀释；在微孔板中分别加入标准品或待检测样品、连接抗体 的受体微球和生物素化抗体各25y以于37°C振动解育20min，然后避光条件下加入链霉亲 和素化的供体微球175yL于37°C振动解育20min后，在A1地aScreen/Lisa检测仪上检测 信号值。
[0013] 进一步，所述步骤⑨方法的建立具体步骤包括：
[0014] (1)将所述已连接抗体的受体微球与IxAphaLISA缓冲液按照1:50~1:100的体 积比进行稀释，作为试剂1 ;
[001引 （2)将所述生物素化抗体与IxAphaLISA缓冲液按照1:200~1:400的体积比进行 稀释，作为试剂2;
[001 引（3)将10 XA1地aLISA assay Buffer用超纯水稀释成1 XA1地aLISA assay Buffer,将所述链霉亲和素化的供体微球用IX A1地aLISA assay Buffer稀释至终浓度为 40 yg/mL，作为试剂3;
[0017] (4)将家蚕蚕卵用PBS缓冲液化Olmol/l，抑7. 4)研磨后，用纱布过滤，取滤液于 500~GOOr/min离屯、2~3min，收集上清液，并将上清液再于3000~3500r/min离屯、10~llmin，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液化Olmol/l,抑7. 4)稀释到5mU作为蚕卵研磨液；
[001引 妨向步骤（4)制备的蚕卵研磨液中加入家蚕微抱子虫，使家蚕微抱子虫在蚕 卵研磨液中的浓度依次为 107spores/mL、l06spores/血、l05spores/mL、104spores/血和 lO^spores/mL；
[0019] (6)标准曲线的建立；取步骤（5)各浓度含有家蚕微抱子虫的蚕卵研磨液、步骤 (1)制备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25 ^以混合均匀，组成标准品实验组；取步 骤（4)制备的蚕卵研磨液、步骤（1)制备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25UL，混 合均匀，作为阴性对照；将所述标准品实验组和阴性对照的样品均于37°C振动解育20min， 然后于避光条件下加入175yL步骤（3)制备的试剂3,再于37°C振动解育20min后，在 A1地aScreen/Lisa检测仪上615皿处，检测标准品实验组的各信号值；W标准品组各浓度 的对数值为横坐标，各浓度标准品的信号值与阴性对照的信号值的比值为纵坐标，绘制标 准曲线；
[0020] (7)待测样品的检测；待测样品采用与步骤（4)相同的方法进行处理，得到待测样 品研磨液；取待测样品研磨液、步骤（1)制备的试剂1和步骤（2)制备的试剂2各25y以混 合均匀，于37°C振动解育20min，然后于避光条件下加入175yL步骤3)制备的试剂3,再于 37°C振动解育20min后，在A1地aScreen/Lisa检测仪上615皿处，检测待测样品的信号值， 并根据步骤（6)建立的标准曲线，进行计算，得到待测样品研磨液中微抱子虫的浓度，进而 检测出家蚕蚕卵中的微抱子虫含量。
[0021] 进一步，所述受体微球和供体微球均为纳米级微粒；所述受体微球表面包被有化 学发光剂和铜系元素館；所述供体微球表面包被有链酶亲和素和光敏剂。
[0022] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0023] 1、本发明方法先采用杂交瘤技术建立鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体杂 交瘤细胞株；通过腹水纯化制备鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体；并通过试验验证 了制得的单克隆抗体稳定性良好，对家蚕微抱子虫具有特异性，可用于家蚕微抱子虫病原 的检测。
[0024] 2、本发明将制得的鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白1G5单克隆抗体包被于AlphaLISA 法的受体微球上，并用生物素标记制得的鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白2D9单克隆抗体，与 供体微球一并组成用于检测微抱子虫的检测试剂盒；采用本发明方法进行检测时，A1地a 供体微珠和受体微珠相互作用，在680nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境 中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应， 最后将能量传递到受体微珠上的館上，发射波长为615nm，进而进行检测。
[0025] 3、采用本发明用于检测微抱子虫的试剂盒进行检测时，在生物分子不存在特异的 相互作用时，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生，进而带来了更高的敏感性 和精确性，检测结果更加精确。
[0026] 4、本发明用于检测微抱子虫的试剂盒具有较高的均一性，且背景干扰少、背景低， 具有广泛的动态检测范围；使用本发明试剂盒进行检测时样本需求量极少，且在检测过程 中无需洗漆，简化了检测流程，具有良好的市场前景。
【附图说明】
[0027] 图1为破碎抱子总蛋白、破碎抱壳碎片、发芽抱子总蛋白和发芽抱壳碎片的 SDS-PAGE图；
[0028] 图2为鼠抗家蚕微抱子虫抱壁蛋白单克隆抗体进行细胞融合后第8天的生长情况 (10X10)；
[0029] 图3为家蚕微抱子虫胞壁蛋白1G5单克隆抗体腹水纯化前后SDS-PAGE电泳鉴定；
[0030] 图4为自制试剂剂量一反应曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料如无 特殊说明，即为普通市售；所采用的生物学试验如无特殊说明，即为常规方法。
[0032] -、一种家蚕成品卵微