一种ngal快速检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药试剂领域，具体涉及一种NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)快速检测试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床各科室最常见的急危重症之一。从轻微血肌酐升高到严重无尿性AKI，AKI程度和临床表现不一而足，AKI与患者病死率、慢性肾脏病(CKD)的发生以及维持性透析率密切相关。AKI发病率逐年增高，已由1988年的610例(每百万人)增加至2009年的2888例(每百万人)，全国近10年的统计数据显示，AKI患者占同期住院患者比例为0.28%~3.19%，而在I⑶中更高达30%?50% ;病死率为14.5%~41.9%ο危重症患者尤其老年患者的AKI发生率日益增加，需要接受肾脏替代治疗的AKI死亡率高达50%~80%，全球每年约有200万人死于AKI。因此，如何防治AKI的发生、发展已成为当前肾脏病研宄工作中的一个重点和热点。
[0003]目前，我国AKI临床研宄主要聚焦于AKI流行病学调查、早期分类和诊断、AKI早期生物标记物研宄、特殊类型AKI的诊治及AKI连续性血液净化治疗等。要想更好地对AKI进行定义和分期、实现早期诊断，研发更好的肾脏损伤标志物是一个重要研宄方向。在早期诊断方面，目前研宄较多的生物标志物包括肾损伤分子(KIM)-l、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、IL-18及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C)等。
[0004]中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)，也称为脂质运载蛋白-2 (Lipocalin-2)，是1993年在动物中性粒细胞中发现的与明胶酶结合的分明性蛋白，相对分子质量为25000，属于脂质运载蛋白家族的成员。在生理状态下，中性粒细胞、肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞、胃壁细胞、小肠潘氏细胞、肝胆管细胞、胰腺细胞等分泌少量NGAL，循环NGAL通过肾小球滤过，在近端肾小管重吸收。研宄人员通过缺血性及肾毒性顺上动物模型发现，在损伤发生2h内肾小管上皮细胞NGAL的转录表达有显著升高。大量后续的临床研宄也证实了动物的结果，血液和尿液NGAL在不同年龄、不同疾病患者中都具有较好的急性肾功能损伤(acute kidneyinjure,AKI)预测价值。发生缺血性和毒性肾损伤的过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。
[0005]中国专利(CN101163971B)提出通过对体液中人嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂笼蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)的测定来诊断并监测人的疾病的方法，包括由缺血性损伤(由于对肾脏的血液供给受损)、接触肾毒剂或对移植肾脏的排斥所导致的那些。特别可用于早期检测肾脏对缺血性损伤的反应，缺血性损伤的临床或病理结果通常是急性肾衰竭(ARF)、急性肾小管坏死(ATN)或急性肾小管间质性肾病(ATIN)，并也可用于监测肾病的病程，包括对治疗性措施的反应。
[0006]目前，检测NGAL方法主要有酶联免疫法(中国专利CN101650369)、基于抗体免疫的微型柱测试法(中国专利CN101163971)、胶乳免疫比浊法(中国专利CN102072960A)和NGAL荧光免疫层析定量检测试纸条(中国专利CN202837303U)。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确；胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。免疫层析方法操作简便，但其一方面其灵敏性不高；另一方面由于结合垫上标记物释放不均一、NC膜的差异大、样品层析速度不可控等原因导致检测结果精密度不高。
[0007]为解决上述问题，如果能利用NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)标志物的抗体，以微流控技术为平台，研发出一种针对AKI诊断的NGAL快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于肾损伤的监测，可以提高肾损伤诊断的准确率。则就会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。
【发明内容】
[0008]为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种NGAL快速检测试剂及其制备方法，该方法制备的试剂具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，且试剂制作工艺简便，制作过程对环境无污染，成本低。
[0009]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种NGAL快速检测试剂，包括基片和覆盖在基片上的盖片，其特征在于，所述基片上依序加工有加样区、反应区、检测区和废液区；所述加样区、反应区、检测区和废液区均由微流通道构成；所述加样区放置有用于过滤生物样品的聚酯膜；所述反应区包被有干燥的荧光微球标记抗体，该干燥的荧光微球标记抗体包括焚光微球标记NGAL多克隆抗体和焚光微球标记羊抗鼠IgG (immunoglobulinG，免疫球蛋白G)抗体；所述检测区包被有检测线和控制线，所述检测线包被有NGAL多克隆抗体；所述控制线包被有鼠IgG抗体；所述废液区为具有毛细作用的微流通道构成。
[0010]一种NGAL快速检测试剂的制备方法包括以下步骤:
步骤SI，制备荧光微球标记NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)多克隆抗体和荧光微球标记羊抗鼠IgG抗体；
步骤S2，制备出布满微流通道的基片和盖片；
步骤S3，在基片上制备出加样区、反应区、检测区和废液区；
步骤S4，NGAL快速检测试剂的组装。
[0011]优选的技术方案，所述步骤SI中制备荧光微球标记NGAL多克隆抗体和荧光微球标记羊抗鼠IgG抗体的过程如下:
一、制备焚光微球标记NGAL多克隆抗体
步骤 S01，取 50mM 且 PH 值为 5.0 的 MEST (2- (N-morpholino) ethanesulfonicacid-tween, 2 - (N-吗啉)乙磺酸-吐温)，将NGAL多克隆抗体稀释为体积为100ul，浓度为2mg/ml的抗体溶液；
步骤S02，取10ul的0.02g/100ml的荧光微球，加到步骤SOl制得的抗体溶液中，超声作用I分钟；
步骤S03，室温下，搅拌孵育15分钟；
步骤S04，加入5ul的0.5g/ml的EDC，超声作用I分钟；
步骤S05，加入0.4ul的IM的氢氧化钠，调节pH为6.5 土 0.2，室温下搅拌反应3小时；超声作用I分钟，再加入20ul的IM的甘氨酸，反应30分钟；
步骤S06，在20000g的离心力作用下离心10分钟，弃去上清液并用200ul的PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)重悬，超声作用I分钟；
步骤S07，重复步骤S06两次后，最后将荧光微球用10ul的1%PBSA (含1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液)溶解重悬，即制得荧光微球标记NGAL多克隆抗体；
二、制备荧光微球标记羊抗鼠IgG抗体
步骤S101，取50mM且PH值为5.0的MEST，将羊抗鼠IGG抗体稀释为体积为lOOul，浓度为2mg/ml的抗体溶液；
步骤S102，取10ul的2%的荧光微球，加到步骤SlOl制得的抗体溶液中，超声作用I分钟；
步骤S103，室温下，搅拌孵育15分钟；
步骤 S104，加入 5ul 的 0.5g/ml 的 EDC( 1- (3-DimethyIaminopropyI) -3-ethylcarbodiimidea-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，超声作用I分钟；
步骤S105，加入0.4ul的IM的氢氧化钠，调节pH为6.5 土 0.2，室温下搅拌反应3小时；超声作用I分钟，再加入20ul的IM的甘氨酸，反应30分钟；
步骤S106，在20000g的离心力作用下离心10分钟，弃去上清液并用200ul的PBS重悬，超声作用I分钟；
步骤S107，重复步骤S106两次后，最后将荧光微球用10ul的1%PBSA溶解重悬，即制得荧光微球标记羊抗鼠IGG抗体。
[0012]进一步优选的技术方案，所述步骤S2中制备出布满微流通道的基片和盖片如下: 步骤S21，在70摄氏度条件下，恒温鼓风干燥箱中烘干COC基片；
步骤S22，使用注塑成型法以带有凸起微通道结构的金属材料作为阳模，制备出带微流通道的COC基片和COC盖片，且该带微流通道的COC基片注塑成型有预设加样区、预设反应区、预设检测区、废液区；所述预设检测区带有预设检测线位置和预设控制线位置。
更进一步优选方案，步骤S3中反应区的制备过程如下:使用含有1%BSA的0.0lM的PBS, 1000倍稀释荧光微球标记NGAL多克隆抗体；使用含有1%BSA的0.0lM的PBS，10000倍稀释荧光微球标记羊抗鼠IGG抗体；将稀释后的荧光微球标记NGAL多克隆抗体和稀释后的羊抗鼠IGG抗体混合，得到两种抗体的混合物；使用喷点仪将1ul所述混合物喷点于带有微流通道COC基片上预设反应区的中心，再在37°C摄氏度条件下干燥24小时，即制得试剂的反应区。
[0013]再更进一步优选的技术方案，步骤S3中检测区的制备过程如下:使用喷点仪在带微流通道的COC基片的预设检测区的预设检测线位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗体浓度为2mg/ml的NGAL多克隆抗体；使用喷点仪在带微流通道的COC基片的预设检测区的预设控制线位置滴加2ul含有1%蔗糖的0.0lM的PBS，且抗体浓度为2mg/ml鼠IgG抗体；然后在37°C干燥3小时，即制得带检测线和控制线的检测区。
[0014]步骤S4中NGAL快速检测试剂的组装过程为:在COC基片的加样区加入滤血膜，再将COC盖片覆盖在COC基片上，使用焊接的方式将COC基片和COC盖片封合起来，且所述COC基片和COC盖片上的微流通道形成闭合的通道，即完成试剂的组装。
[0015]本发明相对于现有技术的有益效果为:本发明利用优化的针对NGAL (中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白)标志物的抗体，以微流控技术为平台，开发出针对AKI诊断的NGAL快速检测试剂。与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，应用于肾损伤的监测，可以提高肾损伤诊断的准确率。
【具体实施方式】
[0016]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合【具体实施方式】，对本发明进一步详细