一种基于核酸适配体修饰纳米金的检测手性化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及属于手性识别、比色分析和环境检测技术领域，尤其涉及一种检测 S-布洛芬和R-布洛芬的适配体比色检测方法。
【背景技术】
[0002] 手性对映体的存在是自然界的一种普遍现象，作为生命活动重要基础的生物大分 子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，这些小分子在体内往往具有重要生理功 能。手性对映体在吸收、分布、代谢与排泄过程中，通过与体内大分子的不同立体结合，产生 不同的药理作用和反应。在临床治疗方面，服用对映体纯的手性药物不仅可以排除由于无 效（不良）对映体所引起的毒副作用，还能减少药剂量和人体对无效对映体的代谢负担，对 药物动力学及剂量有更好的控制，提高药物的专一性具有十分广阔的市场前景和巨大的经 济价值。因此，手性对映体的分离、分析，对研宄生命科学、药物化学以及人类健康都具有十 分重要的意义。目前世界上使用的药物总数约为1900种手性药物占50 %以上，在临床常用 的200种药物中，手性药物多达114种。
[0003] 近年来，各种手性识别方法得到了发展。最简单的是旋光度法，但是同一种光学活 性化合物的旋光方向会因测定的条件的改变而发生变化，与立体结构之间缺少任何容易分 辨的联系，通过测定旋光度来识别手性化合物就受到了局限。高效液相色谱法、毛细管电泳 法等是将分离手段结合光度检测来实现的，但是往往需要的手性色谱柱价格昂贵、较大的 试剂损耗且对分离的条件要求很高，分析时间长不利于快速识别。而光谱分析法和电化学 传感器，灵敏度低和识别过程较为复杂。因此有待发展一种简单、快速、灵敏的手性识别方 法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于核酸适体修饰纳米金的手性化合物检测方法，以 核酸适体修饰的纳米金为手性选择试剂，利用适体高选择性和高亲和性的特点，使用一段 可特异性识别S-布洛芬的单链核酸适配体探针（以及可特异性识别R-布洛芬的单链核 酸适配体探针）分别与金纳米粒子结合形成金纳米粒子-S-适配体复合探针和金纳米粒 子-R-适配体复合探针，在有对应的S-布洛芬存在的情况下，S-适配体复合探针与S-布 洛芬特异性结合，从而引起金纳米粒子表面核酸适配体构象变化，使得金纳米粒子对盐的 耐受能力降低从而出现金纳米粒子聚沉出现蓝色的现象；在有对应的R-布洛芬存在的情 况下，S-适配体复合探针不会与R-布洛芬特异性结合，纳米金不会在高盐浓度下聚沉出现 蓝色现象。同理，在有对应的R-布洛芬存在的情况下，R-适配体复合探针与R-布洛芬特 异性结合，引起核酸适配体构象变化，出现金纳米粒子聚沉呈蓝色的现象。相反在有S-布 洛芬存在下R-适配体复合探针复合的纳米金粒子不会出现聚沉呈蓝色的现象。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供了一种基于核酸适配体修饰纳米金的检测手性化 合物的方法，其特征在于，具体步骤包括：
[0006] 第一步：制备金纳米颗粒溶液；
[0007] 第二步：制备S-布洛芬适配体和R-布洛芬适配体中的至少一种；
[0008] 第三步：以S-布洛芬适配体为S-布洛芬的识别探针，将金纳米颗粒溶液，S-布洛 芬适配体溶液、氯化钠溶液和S-布洛芬标准溶液混合，定容，得到标准检测液，反应30min 后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检则检测体系 在650nm和520nm处的吸光值A650和A520,绘制标准曲线；利用该标准曲线检测待测样品 中的S-布洛芬浓度；或者，以R-布洛芬适配体为R-布洛芬的识别探针，将金纳米颗粒溶 液，R-布洛芬适配体溶液、氯化钠溶液和R-布洛芬标准溶液混合，定容，得到标准检测液， 反应30min后，根据金纳米粒子聚沉引起其溶液变色程度的不同，通过紫外分光光度计检 则检测体系在650nm和520nm处的吸光值A650和A520,绘制标准曲线，利用该标准曲线检 测待测样品中的R-布洛芬浓度。
[0009] 优选地，所述的S-布洛芬适配体为长度为40bp的单链DNA探针，5'端修饰了巯基 (-SH);所述的R-布洛芬适配体为长度为40bp的单链DNA探针，5'端修饰了巯基（-SH)。
[0010] 优选地，所述的S-布洛芬适配体的序列为：
[0011] 5 ' -SHACAGCGTGGGCGGTGTCGGATTTTCGTATGGATGGGGATG-3 '。
[0012] 优选地，所述的R-布洛芬适配体的序列为：
[0013] 5'-SHGCGAACGACTTCATAAAATGCTATAAGGTTGCCCTCTGTC-3'。
[0014] 优选地，所述的金纳米颗粒溶液的制备方法为：将0. 01 % (w/v)氯金酸水溶液在 油浴中加热恒温于92±4°C，在搅拌条件下，加入1% (w/v)柠檬酸三钠溶液，氯金酸与柠檬 酸三钠的摩尔比为1 : 300-400,继续搅拌，至溶液变成清亮透明的橙红色或紫红色，得到 20-30nmol/L的金纳米颗粒溶液。
[0015] 更优选地，所述的金纳米颗粒溶液的制备过程中所用到的玻璃器皿均经过彻底清 洁，所述的清洁步骤包括清洗后，用铬酸洗液或王水充分浸泡24h，后用清水将铬酸洗液冲 洗干净，最后用超纯水冲洗3-4遍，放入烘箱充分干燥，待用。多次试验证明，玻璃器皿的清 洁是纳米金制备成功与否的关键，如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金 颗粒的形成，形成颗粒大小不以、颜色微红、无色或浑浊不透明的溶液。所以必须在制备金 纳米颗粒之前将所有玻璃器皿认真清洗。
[0016] 优选地，所述的利用该标准曲线检测待测样品中的S-布洛芬浓度的具体步骤包 括将金纳米颗粒溶液，S-布洛芬适配体溶液、氯化钠溶液和待测样本混合，定容，得到待测 液，反应30min后，通过紫外分光光度计检则检测体系在650nm和520nm处的吸光值A650 和A520,根据标准曲线计算待测样本中S-布洛芬的浓度。
[0017] 优选地，所述的利用该标准曲线检测待测样品中的R-布洛芬浓度的具体步骤包 括：将金纳米颗粒溶液，R-布洛芬适配体溶液、氯化钠溶液和待测样本混合，定容，得到待 测液，反应30min后，通过紫外分光光度计检则检测体系在650nm和520nm处的吸光值A650 和A520,根据标准曲线计算待测样本中R-布洛芬的浓度。
[0018] 优选地，所述的待测样品含有S-布洛芬和R-布洛芬中的至少一个。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0020] (1)本发明提供了一种对目标布洛芬非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗 体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快 速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。
[0021] (2)基于本发明所述的适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将 样品中布洛芬目标物的存在转变为光信号进行快速检测。它将比色方法的高灵敏性和适配 体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不 受样品中其它情况干扰。
[0022] (3)本发明解决了现有布洛芬检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点。 本发明采用可特异性识别布洛芬的核酸适配体应用于比色分析生物传感器，大大提高了检 测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种检测快速，检测成本 低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。
[0023] (4)本发明为通用型检测方法，只需要将与金纳米粒子非特异性结合的核酸适配 体探针的序列进行相应的改变和替换，即可实现其他目标物的快速、现场检测。
【附图说明】
[0024] 图1是S-布洛芬的单链核酸适配体探针在S-布洛芬存在下的透射电镜图
[0025] 图2是R-布洛芬的单链核酸适配体探针在R-布洛芬存在下的透射电镜图
[0026] 图3是S-布洛芬适配体探针、R-布洛芬适配体探针分别手性识别不同浓度的 S-布洛芬、R-布洛芬的A650/A520值。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。各实施例中制备金纳米颗粒所用到的玻璃器皿均经过彻底清洁，所述的清洁步骤 包括清洗后，用铬酸洗液或王水充分浸泡24h，后用清水将铬酸洗液冲洗干净，最后用超纯 水冲洗3-4遍，放入烘箱充分干燥，待用。
[0028] 实施例1 :以S-布洛芬适配体探