一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测领域，尤其是涉及一种基于分子识别的荧光检测叶酸的方 法。
【背景技术】
[0002] 叶酸是维持生物体正常生命活动过程必不可少的一类有机物质，需求量虽少，但 是对维持健康意义重大。叶酸作为一种辅酶，在细胞分裂和生长，以及嘌呤、嘧啶、核酸、蛋 白质的生物合成上发挥着重要的作用，在治疗某些肿瘤和心血管疾病方面也有一定作用。 叶酸缺乏，容易导致生理功能退化及某些疾病如胃肠功能紊乱、智力退化以及神经管畸形 的发生。处于发育期的机体、孕妇、哺乳期妇女、婴儿更加需要补充叶酸；对于巨幼红血球性 贫血，叶酸是一种具有显著疗效的药物。
[0003] 由于叶酸具有特殊的生理功能，特别是对妊娠期、哺乳期妇女和胎儿，叶酸经常作 为营养强化剂用于保健食品及配方食品中。因此，如何测定这些食品中的叶酸含量，以监控 这些食品的质量就变得尤为重要。
[0004] 测定叶酸的分析方法主要有流动注射-化学发光法，高效液相色谱法，分光光度 法，微生物法以及荧光光度法。经典的微生物法检测叶酸虽然灵敏度高，结果准确，但是操 作繁琐，重复性差，实验周期长，容易受到广泛使用的抗生素的影响，检测结果不能区分各 种叶酸盐形式。高效液相色谱法虽然在叶酸分析中应用广泛，但是方法都还不成熟。高效液 相色谱法分离性能很好，但是仪器成本昂贵，同时使用大量有机试剂给环境造成严重污染。 流动注射-化学发光法检测样品中叶酸含量，重现性较差。
[0005] 三维荧光光谱技术是近几十年中发展起来的一种新的荧光分子技术，可以描绘荧 光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱。拥有高灵敏度、高信息量和选择性的 优势，广泛用作光谱指纹分析、临床分析、多组分分析等。当位于基态的荧光物质分子在吸 收了与其相应的特征电子能级一致的光能后，其价电子将从成键或非成键轨道跃迀到反键 轨道上去，这就是激发态产生的本质。处于激发态的分子，经振动弛豫和内部转换等非辐射 的跃迀形式跃迀到第一激发单重态的最低振动能级，由此释放能量返回基态，所发射出的 光辐射就是荧光。物质在一定频率和强度的激发光照射下，如果光被吸收的比例不太大且 溶液的浓度非常小时0. 05)，则荧光物质的浓度与溶液所产生的荧光强度成正比。分 子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物易于发射荧光，具有大的共轭n 键结构、给电子取代基和刚性的平面结构的分子可以发射强荧光。荧光法是分析药物和食 品中各种维生素的较好方法，具有快速、灵敏、选择性好的优点。但是现有荧光分析法主要 利用强氧化剂氧化叶酸，取得其分解产物产生的荧光，进行含量检测，操作起来比较费时费 力，过程繁琐，另外由于叶酸的不完全分解会导致干扰较多，重现性差。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明提供一种在不破坏叶酸分子的前提下利用荧光 光谱法快速、有效地检测叶酸含量的方法。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于分子识别的荧光检测叶酸 的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008] 1)合成识别分子：将乳清酸与1，12-二氨基十二烷水溶液混合，常温搅拌反应 80~100小时得到混合液，将所述混合液除去水分得到浓缩产物，将所述浓缩产物用无水 乙醇洗涤，真空干燥后得到1，12-二乳清酸基十二烷基二胺盐（DDO)，其反应方程式如下：
[0010] 2)配制标准液：称取磷酸二氢钠和氢氧化钠溶于水，用盐酸调节其pH值为7. 0~ 7. 8,得到磷酸缓冲溶液；称取叶酸溶解于磷酸缓冲溶液中，得到叶酸标准溶液；称取DDO溶 解于磷酸缓冲溶液中，得到DDO标准溶液；
[0011] 3)测定三维荧光光谱特定条件：叶酸激发光波长为400nm，发射光波长为460nm; DDO激发光波长为320nm，发射光波长为390nm;
[0012] 4)测定荧光强度：在DDO浓度为4.0X10_4m〇l/L，激发光波长为320nm，发射光波 长为390nm，激发电压为800V，激发光源透过孔径均为5.Onm，发射光源透过孔径均为5.Onm 的条件下，改变叶酸的浓度，测定不同叶酸浓度下DDO溶液的荧光强度；
[0013] 5)得出线性方程：根据步骤4)得出DD0溶液的荧光强度（F)与叶酸的浓度（cp) 间具有线性关系，线性方程为F= 3116. 99 - 28. 4759cp，相关系数y为0. 9959,检出限为 1. 25Xl(T6m〇l/L;
[0014] 6)取lmL叶酸标准液，依步骤3)的方法测定荧光值，计算出叶酸的浓度。
[0015] 进一步的，步骤1)中乳清酸与1，12-二氨基十二烷的摩尔比为2:1。
[0016] 进一步的，步骤1)中反应时间为95~98小时。
[0017] 进一步的，步骤2)中DD0的溶解为常温下利用超声振荡仪超声溶解。
[0018] 本发明的有益效果是，不需要将叶酸分解就能利用荧光光谱仪检测叶酸的含量， 操作过程简便，重复性好，准确性高，对采样量限制小，较少量的样品就可以达到检测目的， 实验周期短，实验方法简单，成本低。
【附图说明】
[0019] 图1为叶酸水溶液的三维荧光扫描光谱图；
[0020] 图2为叶酸水溶液的荧光强度随浓度变化趋势图；
[0021] 图3为DD0水溶液的三维荧光光谱；
[0022] 图4为DD0缓冲溶液的荧光强度随浓度的变化趋势图；
[0023] 图5为缓冲液中的叶酸荧光强度随DD0浓度的变化趋势；
[0024] 图6为DD0对叶酸荧光光谱的影响；
[0025] 图7为叶酸缓冲液的荧光强度随乳清酸浓度的变化趋势；
[0026] 图8为叶酸对DD0荧光光谱的影响；
[0027] 图9为叶酸对DDO荧光猝灭的Stern-Volmer曲线；
[0028] 图10为叶酸对DD0荧光猝灭的双对数曲线；
[0029] 图11为DD0的荧光强度随叶酸浓度变化趋势。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。
[0031] 本发明的机理：
[0032] 叶酸的识别分子为如式（I)所示的1，12-二乳清酸基十二烷基二胺盐（简称 DD0)，可以自发地在水溶液中形成囊泡并产生分子识别作用。叶酸分子结构具有能与其头 基产生具有分子识别作用的三重氢键的特点。本发明通过荧光光谱法研宄这种bola型两 亲分子1，12-二乳清酸基十二烷基二胺盐（DD0)表面活性剂与叶酸的相互作用，据此建立 了在叶酸分子结构不被破坏基础上的荧光分析法检测叶酸新方法。
[0034] 1、叶酸自身荧光性质考察
[0035] 利用三维荧光光谱仪考察叶酸三维荧光谱图，如图1所示，叶酸具有荧光性，且叶 酸浓度为5.OXKTVol/L，激发波长为400nm，发射波长为460nm时具有最大荧光强度。
[0036] 设定三维荧光光谱仪的激发波长为400nm，发射波长为460nm，激发电压为800V， 光源透过孔径为5.Onm，测定叶酸在不同浓度下的荧光强度。如图2所示，在25°C的试验温 度下，叶酸的荧光强度随着叶酸浓度的增加而增强，当浓度达到1. 〇Xl(T3m〇l/L，荧光强度 达到了一个平台期，直到浓度达到2.OXl(T3m〇l/L范围内，当浓度大于2.OXl(T3m〇l/L时， 荧光强度随浓度的增大而减小，叶酸在这个过程中发生了荧光自猝灭现象。
[0037] 叶酸的荧光强度对pH值很敏感，受缓冲溶液pH值的影响很大，只有在中性或碱性 条件下，叶酸才能显示出足够的荧光信号，结合人体血液的pH值，本发明采用pH7. 0~7. 8 的磷酸盐缓冲液研宄叶酸的荧光行为。
[0038] 2、DD0自身荧光性质考察
[0039] 利用三维荧光光谱仪测定DD0三维荧光谱图，如图3所示，DD0具有荧光性，且DD0 的浓度为1. 〇Xl(T3m〇l/L，激发波长为320nm，发射波长为390nm时具有最大荧光强度。 [0040] 设定三维荧光光谱仪的激发波长为320nm，发射波长为390nm，激发电压为800V， 光源透过孔径为5.Onm，测定DD0在不同浓度下的荧光强度。如图4所示，在25°C的试验温 度下，DD0缓冲溶液的荧光强度在浓度范围2.OXl(T4m〇l/L到2.OXl(T3m〇l/L内呈线性关 系。
[0041] 3、DD0对叶酸的荧光增强效应研宄
[0042] 固定叶酸浓度为5.OXl(T4m〇l/L，改变DD0浓度，测定不同DD0浓度下的体系荧 光强度以及叶酸发射波长随DD0浓度变化情况。如图5所示，在25°C的试验温度下，叶 酸的荧光强度值随加入DDO分子的浓度增大而增大。随着DDO的浓度增加，叶酸的荧光 强度先急剧增加（斜率1为1. 06X10 6L/mol)，到达某一拐点后，缓慢增加（斜率1(2为 2. 65X105L/mol)。该拐点对应的浓度为2. 24Xl(T4m〇l/L，此点恰是DD0的临界聚集浓度， 说明DD0单体状态和囊泡聚集体对叶酸荧光强度的影响不同。如图6所示，在25°C的试验 温