一种羧基微球标记蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫诊断试剂盒制备技术领域，具体地，涉及一种新的、成本低、操作 简便的羧基微球标记蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 纳米微球被广泛地应用于体外诊断试剂中，极大地提高了试剂的灵敏度，可以检 测到样本含量极微的物质。纳米微球在诊断试剂中作为载体，大小均一，微球表面包被抗 体、抗原等蛋白分子，蛋白分子吸附到纳米微球上，方法有两种：物理吸附和化学偶联。物理 吸附是比较传统有效的方法，但是其也有对体系变化敏感，稳定性差的缺点；化学偶联可以 避免这些缺陷。化学偶联狭义上是指利用市售的活性交联剂，把蛋白和纳米微球通过化学 反应连接在一起，一旦连接成功，纳米微球会非常稳定。
[0003] 用于化学偶联的纳米微球表面会被修饰一些化学基团，譬如羧基、氨基、羟基等， 其中羧基微球应用比较广泛。把羧基活化，进一步与抗体等蛋白分子交联，目前普遍的方法 有两种：一步法，是指在合适条件下，把交联剂碳二亚胺（EDC)、羧基微球和蛋白分子三种 成分混合在一起，反应1个小时以上，再终止反应，离心或者切向流过滤等方法把羧基微球 分离出来；两步法，引入了另外一种试剂，即N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)或Sulfo-NHS，具体 操作为先在羧基微球中同时加入EDC和NHS或Sulfo-NHS，室温活化5~20min，再通过离 心或切向流过滤等方法去掉多余的EDC和NHS或Sulfo-NHS，然后用pH7~9的缓冲液重 悬，加入抗体室温反应3h以上，再通过离心或切向流过滤等方法把偶联了蛋白分子的羧基 微球分离出来，用合适的缓冲液重悬储存。
[0004] 一步法的优点是操作简单，利用EDC作为交联剂，虽然比较简便，但是这种方法不 可控，最终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个抗体自连产物，这样不仅浪费抗 体，还大大降低了反应率。二步法是利用EDC和NHS或Sulfo-NHS作为交联剂，因为反应是 分步进行，第一步活化羧基，洗涤微球后再加入抗体，所以反应的方向是一定的，具有可控 性，活化后洗涤微球最常用有两种方法，一是离心，这种方法不仅费时费力，而且高速离心 过程中微球的距离越来越近，表面电荷相互作用，可能会导致微球的自连沉淀，严重影响偶 联的效率；二是切向流过滤，这种方法不会导致胶乳沉淀，但是其耗时较长，影响第二步反 应的效率；如果是磁性羧基微球，则比较方便，可以使用磁性分离系统洗涤微球。两种化学 偶联的方法的共同缺点是对反应条件的要求比较苛刻，比如一步法必须在偏酸性环境下反 应，两步法的第一步必须在偏酸性环境下，第二步最好在偏碱性环境下。因此本领域迫切需 要一种偶联反应可控、有效，操作简便的羧基微球偶联蛋白的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、用时少、偶联效率高的羧基微球标 记蛋白的方法。
[0006] 本发明提供的一种羧基微球标记蛋白的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将羧基微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0 ;
[0008] (2)按照EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体系中 加入EDC ;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0009] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0010] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10~50mM Tris，0. 1 ~1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 0 ~8. 0〇
[0011] 本发明所述的羧基微球为羧基胶乳微球或羧基磁性微球。
[0012] 本发明方法步骤（1)中，羧基微球溶于活化液的终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0013] 本发明方法步骤（2)搅拌时间为10~20min。搅拌方法可以为磁珠搅拌，也可以 为玻棒搅拌。
[0014] 优选地，本发明方法步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1， EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0015] 本发明方法步骤（3)加入待标记蛋白后使其终浓度为0. 1~lmg/mL。
[0016] 本发明所述的胶乳微球，直径大小为50~200nm，表面羧基含量为0. 1~ 0. 3mmol/g，大小均一。
[0017] 本发明所述的待标记蛋白可以为抗原、抗体、亲和素等其他应用于生物技术领域 的诊断、检测用蛋白。待标记蛋白的初始浓度5~1 Omg/mL。
[0018] 本发明方法步骤（3)搅拌时间为2~4h。
[0019] 本发明方法步骤（4)用储存液重悬胶乳颗粒使其终浓度为0. 5%~1%，所述％为 质量百分比。
[0020] 步骤（4)中的分离方法可采用离心或者切向流过滤方法是胶乳颗粒与未连接的 抗原、抗体或其他待标记的蛋白分离。
[0021] 本发明提供了上述方法在制备适用于免疫比浊法的抗原或抗体检测试剂盒中的 应用。
[0022] 本发明还提供了一种以羧基胶乳微球为载体的检测试剂盒，含有R1试剂和R2试 剂，
[0023] 其中R1试剂为：在10~50mM Tris，pH值为7~9的缓冲液中加入终浓度为2. 5% 的NaCl、0. 5%的Tween-20,搅拌均匀即得；
[0024]R2试剂通过以下方法制备得到：
[0025] (1)将羧基胶乳微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0026] (2)按照EDC与羧基胶乳微球表面羧基含量的摩尔比0.8~2:1，向步骤⑴的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0027] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0028] (4)使微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris， 0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0029] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（2)中，EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比 为 1:1，EDC :NHS 或 Sulfo-NHS 的摩尔比为 1:1。
[0030] 进一步地，R2试剂制备方法的步骤（3)中，立即调节步骤（2)体系的pH值为9. 5。
[0031] R2试剂制备方法的步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05 %~ 〇. 1%，所述％为质量百分比。
[0032] 本发明还提供一种以羧基磁性微球为载体的检测试剂盒，含有磁微粒分离试剂， 所述磁微粒分离试剂是通过以下方法制备得到的：
[0033] (1)将羧基磁性微球溶于活化液中，所述活化液为10~50mM MES，pH 5. 0~7. 0;
[0034] (2)按照EDC与羧基磁性微球表面羧基含量的摩尔比0? 8~2:1，向步骤（1)的体 系中加入EDC;再加入NHS或Sulfo-NHS，使其与EDC的摩尔比为1~3 :1，边加边搅拌；
[0035] (3)立即调节步骤⑵体系的pH值为8~10,调节完毕立即加入待标记的蛋白， 搅拌；
[0036] (4)使羧基磁性微球与未标记蛋白分离，用储存液重悬微球，所述储存液为10mM Tris,0. 1% BSA,0. 1% NaN3, pH 7. 5〇
[0037] 优选地，步骤（2)EDC与羧基微球表面羧基含量的摩尔比为1:1，EDC:NHS或 Sulfo-NHS的摩尔比为1:1。
[0038] 步骤（4)中，用储存液重悬胶乳微球使其终浓度为0. 05%~0. 1%，所述％为质量 百分比。
[0039] 在本发明的一个实施例中，偶联的待标记蛋白为链霉亲和素。将偶联了链霉亲和 素的羧基磁性微球用10mM Tris，0. 1 % BSA，0. 1 % NaN3, pH 7. 50的溶液稀释到0. 01 %。
[0040] 本发明的羧基微球标记蛋白的方法具有以下优点及有益效果：
[0041] (1)操作简便，实现羧基微球与待标记蛋白的高效偶联。
[0042] (2)通过加入合适比例的交联剂，使微球表面的羧基数量和活化的羧基数量处于 最佳比例，有利于蛋白标记和应用于胶乳免疫比浊试剂盒中。
[0043] (3)通过调节pH值使得反应体系快速从利于活化的条件转为利于蛋白标记的状 态，且针对传统的两步法进行了改进，对于羧基胶乳微球，传统的两步法通过离心等方法洗 涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明方法在加入待标记蛋白前，省去了离心或切 向流过滤的步骤，避免了胶乳颗粒沉淀和活化的中间产物水解；对于羧基磁性微球，传统的 两步法通过磁性分离系统洗涤微球后再加待标记蛋白进行反应，而本发明省去了洗涤这一 个步骤，节约了时间，在活化中间产物半衰期之内尽快进行下一步反应。
[0044] (4)与现有技术的微球标记方法相比，经过本发明方法能够有效降低试剂的用量， 节省了成本。
【附图说明】
[0045] 图1为根据BSA蛋白标准作的标准曲线。
[0046]图2为采用本发明实施例2制得的试剂盒对6种不同浓度标准品检测结果作的标 准曲线图。
[0047] 图3为采用本发明实施例4制得的试剂盒检测结果的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0048] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0049] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 实施例中所用的试剂为市售商品。本发明实施例所述的活化液为10~50mM MES，pH5. 0~ 7. 0 ;所述储存液为 10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 5。
[0050] 实施例1羧基胶乳微球标记胱抑素C抗体
[0051] 胱抑素C抗体为东方酵母公司产品，多抗，浓度为15mg/mL。该抗体仅与人胱抑素 C反应，与其他抗原无交叉免疫反应，基本满足本试验所需。胶乳微球为JSR公司产品，粒 径为61nm，羧基含量为0. 190mmol/g，浓度为5. 2%，溶液为0. 09%叠氮化钠的纯化水。EDC 和NHS为Pierce公司产品。
[0052] 胶乳微球用10mM MES，pH 6. 00的活化液配制成0. 5%的溶液，搅拌均匀，根据胶 乳颗粒表面的羧基含量，按照摩尔比EDC:NHS: -C00H = 1:1:1的比例，计算所需EDC和NHS 的量，称取后直接加入到胶乳微球溶液中，边加边搅拌，室温搅拌反应15min。立即用NaOH 调节胶乳颗粒溶液pH值为9. 80,随即加入用活化液稀释了浓度为5mg/mL的胱抑素C抗 体，使抗体终浓度为〇. 5mg/mL，边加边搅拌，室温搅拌反应3h。反应完成后，离心清洗胶乳 颗粒，最后使连接有胱抑素C抗体的胶乳微球保存在10mM Tris，0. 1% BSA，0. 1% NaN3, pH 7. 50的溶液中，微球浓度为0. 5%，可以长期保存。
[0053] 可以通过测定离心后上清中的胱抑素C抗体剩余量来测定抗体的偶联