一种克伦特罗检测工作液及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，涉及一种克伦特罗检测工作液及检测方法。
【背景技术】
[0002] 克伦特罗是β -受体激动剂的一种，用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气 肿等疾病。大剂量用在饲料中能促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、改 善肉质和提高饲料转化率，因此又叫"瘦肉精"。
[0003] 然而，克伦特罗使用后会在畜禽组织中形成残留，尤其是在猪的肝脏等内脏器官 残留较高，食用后进入人体会引起心血管和中枢神经系统的毒副作用，直接危害人体健康， 因此，中国农业部早在1997年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用。2001年12月27 日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物禁止使用β激动剂类药 物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）。
[0004]由于"瘦肉精"能带来更多经济价值，长期以来作为非法添加药物在畜牧生产中被 大量使用。中国最早报道的瘦肉精中毒事件是1998年供港活猪引起的，此后这类事件经常 发生，2009年4月27日，《联合早报》报道：中国产牛肉产品（牛肉油、牛肉汤）再被韩国查 出含盐酸克伦特罗。2011年震惊全国的河南双汇"3. 15" "瘦肉精"事件，更是把"瘦肉精" 残留推上了风口浪尖。"瘦肉精"残留事件已成为我国养殖业和肉食品安全领域的毒瘤，严 重阻碍了我国畜牧业的发展和食品安全体系建立。
[0005] 目前检测克伦特罗的方法主要分为两大类：仪器分析方法和免疫分析方法。仪器 分析方法主要包括气相色谱质谱联用法（GC-MS，GC-MS/MS)，高效液相色谱法（HPLC)，高效 液相色谱质谱联用法（HPLC-MS，HPLC-MS/MS)，毛细管电泳法（CE)等。免疫分析方法主要 包括酶联免疫法（ELISA)，放射免疫分析法（IA)胶体金免疫亲和层析法（GICA)等。然而由 于食品样品的复杂性和样品数量巨大，现有的分析方法已不能满足β -受体激动剂快速高 通量筛查的需要。因此需要建立一种快速、简单、灵敏、低成本的方法检测食品中的克伦特 罗；农业部235号公告规定中对克伦特罗的要求为在所有食品动物所有可食组织中不得检 出。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术中的缺陷和不足，提供了一种克伦特罗检测的新思路，解决 了现有的检测手段不能快速、多种类检测样品且检测过程费时费力的问题。
[0007] 为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
[0008] -种克伦特罗检测工作液，该工作液为纳米金胶体和三聚氰胺溶液混合后得到的 胶体溶液，其中：所述的纳米金胶体的胶体粒径小于8nm ;所述的三聚氰胺溶液的浓度为 4 ~6 μ M0
[0009] 具体的，所述的纳米金胶体和三聚氰胺溶液的体积比为7~11:1。
[0010] 一种克伦特罗检测方法，将所述的克伦特罗检测工作液与克伦特罗标准溶液、双 氧水和TMB进行显色反应得到标准比色液；
[0011] 待测样品溶液与权利要求1或2所述的克伦特罗检测工作液、双氧水和TMB进行 显色反应得到待测样品显色液；
[0012] 将待测样品显色液与标准比色液进行比对得到科伦特罗含量检测范围值。
[0013] 具体的，所述的克伦特罗检测工作液与克伦特罗标准溶液的体积比为4. 9~ 3. 8 : 1，克伦特罗标准溶液的浓度为0 μ M、5 μ M、10 μ M、20 μ M、30 μ M和50 μ M。
[0014] 更具体的，所述的待测样品溶液包括尿液样品稀释液和生物体组织样品提取液。
[0015] 进一步的，该检测方法还包括通过吸光光度法对标准比色液进行的吸光度测定得 到吸光度与科伦特罗浓度标准曲线，再通过吸光光度法进行待测样品显色液的吸光度测定 得到科伦特罗浓度值。
[0016] 本发明的有益效果为：
[0017] (1)本发明将克伦特罗与三聚氰胺协同诱导纳米金的聚集作用及纳米金模拟酶的 催化活性相结合，可检测样品中的克伦特罗，为以后的研宄、生产和监管等提供了必要的支 持；
[0018] (2)同时本发明通过一系列的研宄发现8nm以下的纳米金胶体与三聚氰胺混合后 作为检测工作液与不同浓度的克伦特罗混合后，催化TMB和双氧水显色得到显示不同颜色 的溶液，不仅能进行尿液样品中克伦特罗的检测，还能进行动物组织样品中克伦特罗的检 测，扩大了克伦特罗能检样品的种类；
[0019] (3)另外，本发明制备的检测工作液能在4°C下保存7天，可以随取随用，与待检样 品混合再加入TMB和双氧水显色后即可进行检测，与现有的先将三聚氰胺和不同浓度的克 伦特罗混合再加入纳米金后显示不同的颜色相比减少了因吸取微量液体这种操作引起的 误差，同时操作过程比较方便，减少了一次吸取液体的操作。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中仅含不同浓度的克伦特罗检测工作液的颜色照片，从左至右克 伦特罗的浓度（μM)依次为0、5、10、20、30和50 ;
[0021] 图2为实施例1中加入双氧水和TMB后的含不同浓度的克伦特罗检测工作液的颜 色照片，从左至右克伦特罗的浓度（μΜ)依次为0、5、10、20、30和50 ;
[0022] 图3为实施例1中得到的含不同浓度的克伦特罗检测体系的比色卡，从左至右克 伦特罗的浓度（μΜ)为0、5、10、20、30和50 ;
[0023] 图4为实施例2中检测工作液中的纳米金透射电镜图，A图表示不含克伦特罗的 检测工作液中纳米金的透射电镜图，B图表示含有克伦特罗（30 μΜ)的检测工作液中纳米 金的透射电镜图；
[0024] 图5为实施例3中标号的三种不同体系溶液的光谱图，插图为相应的照片，图中的 标号1、2和3分别表示不同体系的样品溶液；
[0025] 图6为实施例1中含不同浓度的克伦特罗检测体系的标准曲线；
[0026] 以下结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做具体说明。
【具体实施方式】
[0027] 本发明所述的TMB即四甲基联苯胺。
[0028] 本发明的具体原理为低浓度的三聚氰胺可以吸附在纳米金表面，克伦特罗 的-NH2、-NH、-OH和-Cl与三聚氰胺的烷基-NH2和芳香-NH-基团形成氢键，这样克伦特罗 作为一种"交联剂"，协同三聚氰胺引起纳米金的聚集，纳米金聚集后催化活性变高，催化 TMB和双氧水显色后的颜色变深；
[0029] 同时本发明通过一系列的研宄发现粒径小于8nm的纳米金胶体与低浓度的三聚 氰胺作为检测工作液，可选的三聚氰胺的浓度为〇. 5uM，与不同浓度的克伦特罗混合后再加 入TMB和双氧水显色后进行检测，不仅能进行尿液样品中克伦特罗的检测，还能进行动物 组织样品中克伦特罗的检测，扩大了克伦特罗能检样品的种类；
[0030] 本发明的尿液样品溶液可通过纯净水稀释到一定浓度后过滤得到待测尿液样品 溶液；本发明的生物体组织样品提取液，以猪瘦肉为例，可通过匀浆后的猪瘦肉加酸化乙醇 用玻璃棒搅散肉团，于振荡器上振摇提取，离心取上清液调pH>12,用正己烷提取，合并正己 烷提取液用旋转蒸发器浓缩至干，残渣用纯净水溶解，用0. 25 μ m滤膜过滤得到。
[0031] 实施例1 :检测工作液的制备和克伦特罗的检出限
[0032] 1、材料/试剂：
[0033] 氯金酸、硼氢化钠、醋酸钠和双氧水和TMB购自国药集团化学试剂有限公司，三聚 氰胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司，克伦特罗购自中国食品药品鉴定研宄所，实验 用水均为纯净水；
[0034] 2、方法：
[0035] (1)制备纳米金胶体：所有的玻璃仪器都需用王水浸泡过夜，纯净水冲洗，烘干备 用；向79mL水中加入25mM的氯金酸溶液lmL，在剧烈搅拌下一次性加入新制的1%的硼氢 化钠溶液2mL，继续避光搅拌1小时，用0. 25 μ m滤膜过滤，4°C保存备用，所制得的具有模拟 过氧化物酶活性的纳米金胶体的胶体粒径为8nm ;
[0036] (2)检测工作液：在50mL的烧杯里加入⑴中得到的纳米金胶体30mL和5 μ M三 聚氰胺3mL，并将搅拌3min使之均匀，制成检测工作液，工作液可在4°C下保存7天；
[0037] (3)取5个2mL的小玻璃瓶分别依次加入步骤⑵制备的检测工作液200 μ L和不 同浓度的克伦特罗50 μ L，室温反应15min，随后依次加入I. 4Μ的双氧水200 μ L，8. 3mM的 TMB200 μ L，0. 05M的乙酸钠缓冲溶液（pH = 4. 5) 200 μ L，室温反应30min，由于克伦特罗协 同三聚氰胺诱导纳米金聚集，使纳米金的催化活性提高不同，最终体系的颜色深浅不同；
[0038] (4)所用克伦特罗的浓度依次为：(^]?、5 4]\1、1(^]\1、2(^]\1、3(^]\1和5(^]\1，添加 到检测工作液中，目测TMB的氧化产物颜色变化，并对TMB氧化产物的吸收光谱进行测定；
[0039] 3、结果：
[0040] 结合图1、2和3,图1中的照片图为仅含有不同浓度的克伦特罗溶液的检测工作液 的颜色图，图2为加入I. 4M的双氧水200 μ L、8. 3mM的TMB200 μ L和0. 05M的乙酸钠缓冲 溶液（pH = 4. 5) 200 μ L且室温反应30min后的溶液颜色图，通过两幅图片的对比可知：克 伦特罗浓度越高，TMB的氧化产物蓝色越深，可得到蓝色深浅检测比色卡，见图3 ;且单纯的 克伦特罗与纳米金胶体溶液混合显色（图1)与对双氧水的催化后的颜色变化结合克伦特 罗与纳米金胶体溶液混合显色（图2)相比，明显的图2中的颜色更加的容易进行判断，有