检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物技术领域中检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量的方法。
【背景技术】
[0002] 目前动物保护的研宄人员越来越多的开始采用非损伤性的取样方法，即在不触 及、捕获、甚至是在未亲眼见到动物的情况下，收集动物不同形式的样品，例如粪便、尿液、 毛发、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等，进而对采集样品中相关 生理代谢产物进行提取和测定。目前应用较为广泛的是对研宄目标物种的粪便进行采 集，并对粪便中相关生理代谢产物通过乙醇提取进而利用酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)进行定量测定。但是，高浓度的乙醇会对ELISA的测定结 果造成影响。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何利用酶联免疫法检测动物粪便乙醇提取物中 待测物的含量。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量 的方法。
[0005] 本发明所提供的检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量的方法，包括下述1)和 2):
[0006] 1)调节所述粪便乙醇提取物中乙醇的浓度，得到待测粪便乙醇提取物，所述待测 粪便乙醇提取物中乙醇的体积百分比浓度大于〇小于7% ;
[0007] 2)利用酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)检测所述待 测粪便乙醇提取物中所述待测物的含量，得到所述粪便乙醇提取物中所述待测物的含量。
[0008] 上述方法中，所述动物可为林麝（Moschusberezovskii)。
[0009] 上述方法中，所述待测粪便乙醇提取物中乙醇的体积百分比浓度可大于0小于等 于6%，如5%或4%。
[0010] 上述方法中，所述待测粪便乙醇提取物中乙醇的体积百分比浓度可大于0小于等 于5 %，如4 %。
[0011] 上述方法中，所述待测粪便乙醇提取物中乙醇的体积百分比浓度可大于0小于等 于4%〇
[0012] 上述方法中，所述粪便乙醇提取物可为用乙醇水溶液浸提所述动物粪便得到的浸 提液。
[0013] 上述方法中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比浓度可为90 %。
[0014] 上述方法中，所述动物为雄性动物；所述待测物可为睾酮。
[0015] 上述方法中，所述粪便乙醇提取物中所述睾酮含量的测定利用睾酮定量测定试剂 盒进行。
[0016] 所述睾酮定量测定试剂盒（酶联免疫法）为北京北方生物技术研宄所产品。
[0017] 实验证明，利用本发明的检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量的方法测定雄性 林麝粪便乙醇提取物中睾酮的含量，雄性林麝粪便乙醇提取物中乙醇体积百分比浓度大于 0小于7%时，对酶联免疫反应测定睾酮含量的影响较小。实验证明，可将动物粪便乙醇提 取物中乙醇体积百分比浓度调至小于7 %后利用本发明的检测动物粪便乙醇提取物中待 测物含量的方法测定睾酮及其他待测物的含量。
【附图说明】
[0018] 图1为根据不同待测粪便乙醇提取物得到的雄性林麝粪便乙醇提取物中睾酮含 量的测定值。其中，乙醇百分比浓度表示乙醇体积百分比浓度。
[0019] 图2为不同乙醇体积百分比浓度的S3待测液中的睾酮含量的测定结果。
[0020] 图3为不同乙醇体积百分比浓度的S4待测液中的睾酮含量的测定结果。
[0021] 图4为不同乙醇体积百分比浓度的S5待测液中的睾酮含量的测定结果。
[0022] 图5为不同乙醇体积百分比浓度的S3'待测液中的睾酮含量的测定结果。
[0023] 图6为不同乙醇体积百分比浓度的S4'待测液中的睾酮含量的测定结果。
[0024] 图7为不同乙醇体积百分比浓度的S5'待测液中的睾酮含量的测定结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0026] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 检测动物粪便乙醇提取物中待测物含量的方法，包括下述1)和2):
[0029] 1)调节所述粪便乙醇提取物中乙醇的浓度，得到待测粪便乙醇提取物，所述待测 粪便乙醇提取物中乙醇的体积百分比浓度小于7% ;
[0030] 2)利用酶联免疫法检测所述待测粪便乙醇提取物中所述待测物的含量，得到所述 粪便乙醇提取物中待测物的含量。
[0031] 下面以雄性林麝为例，阐明本发明动物粪便乙醇提取物中睾酮含量的测定方法。
[0032] 实施例1、雄性林麝粪便乙醇提取物中睾酮含量的测定
[0033] 1、雄性林麝粪便乙醇提取物的制备
[0034] 选取陕西宝鸡片仔癀林麝养殖场的雄性林麝，将其新鲜粪便在粉碎机（23000rpm) 中粉碎IOmin混匀，得到雄性林麝粪便。
[0035] 称取上述雄性林麝粪便0.5g于IOml塑料离心管中，向该离心管中加入5ml乙 醇体积百分比浓度为90 %的乙醇水溶液，用涡旋仪振荡20min后，在2500rpm(离心力 为4360g;离心机为北京医用离心机厂的低速自动平衡离心机，型号为LDZ 5-2)下离心 15min，收集上清液，即为雄性林麝粪便乙醇提取物。
[0036] 2、雄性林麝粪便乙醇提取物中睾酮含量的测定
[0037] 按照下述方法，测定步骤1的雄性林麝粪便乙醇提取物中睾酮含量：
[0038] 取5mL步骤1的雄性林麝粪便乙醇提取物，分别用样品缓冲液（PBS缓冲液）（PBS 缓冲液的具体配置方法为：称取8. 5g NaCl、2. 2g Na2HPOjP 0. 3g NaH2PO4溶于800ml高纯 水中，加入0. 5ml吐温，定容至1L)进行梯度稀释，分别得到乙醇体积百分比浓度为4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %或15 %的待测粪便乙醇提取物。
[0039] 设置不含乙醇的待测粪便乙醇提取物（即乙醇体积百分比浓度为0的待测粪便乙 醇提取物）作为对照，不含乙醇的待测粪便乙醇提取物的制备方法为：取5mL步骤1的雄性 林麝粪便乙醇提取物蒸干，得到蒸干的提取物，向蒸干的提取物中加入5ml PBS缓冲液后用 超声波仪（昆山市超声仪器有限公司生产的KQ3200E台式仪）进行超声震荡提取，得到不 含乙醇的待测粪便乙醇提取物。
[0040] 采用酶联免疫法测定上述各待测粪便乙醇提取物中睾酮的含量。酶标分析仪为 ThermoMultiscan FC型，采用睾酮定量测定试剂盒（酶联免疫法）（该试剂盒为北京北方生 物技术研宄所产品），该试剂盒的的主要成分见表1和表2,睾酮定量测定试剂盒（酶联免 疫法）的主要技术参数如下：
[0041] a.灵敏度：< 0· 05ng/ml
[0042] b.精密度：变异系数CV〈15 %
[0043] c.特异性：与孕酮、雄二醇、DHT没有交叉反应
[0044] 表1、睾酮定量测定试剂盒（酶联免疫法）的主要成分
[0045]
[0047] 表2、睾酮定量测定试剂盒（酶联免疫法）中校准品的浓度
[0048]
[0049] 睾酮定量测定试剂盒（酶联免疫法）中质控品浓度：低值（L) 0· 22-0. 58ng/ml ;高 值⑶：1.75-4. 13ng/ml。
[0050] 实验重复三次，每次重复实验的具体操作如下，下述步骤中的试剂均为睾酮定量 测定试剂盒（酶联免疫法）中试剂：
[0051] A、将下述步骤中的各种试剂移至室温（18-25°C )平衡半小时；取浓缩洗涤液，用 蒸馏水稀释20倍，混匀后得到稀释的洗涤液。
[0052] B、将预包板从密封袋中取出，每个校准点及质控一次各设两孔，每孔加入相应校 准品及质控各50 μ 1 ;其余每个检测孔直接加一种待测粪便乙醇提取物50 μ 1。设一个空白 对照孔（该孔不加任何液体）。
[0053] C、每孔加入酶标抗原50 μ L(空白对照孔不加酶标抗原），再向每孔加入抗体 50yL。充分混匀，贴上不干胶封片，置37°C温育1小时。
[0054] D、手工洗板：弃去孔内液体，用步骤A的稀释的洗涤液注满各孔，静置10秒甩干， 重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序后拍干。
[0055] E、每孔加显色剂A 50 μ L，显色剂B 50 μ L，振荡混匀后，置37°C避光显色15分钟， 每孔加终止液50 μ L。
[0056] F、用酶标仪读数，测定各孔OD值。
[0057] G、数据处理
[0058] 根据校准品的浓度与OD值的关系通过Logit-Iog直线回归作出标准曲线Y = BX+A，A为标准曲线截距，B为标准曲线斜率，将待测粪便乙醇提取物得到的吸光值减本底 后作为Y带入标准曲线中得到待测粪便乙醇提取物中睾酮的含量X。
[0059] 根据待测粪便乙醇提取物中睾酮的含量计算得到步骤1的雄性林麝粪便乙醇提 取物中睾酮含量的测定值（表3和图1)。
[0060] 表3、根据不同待测粪便乙醇提取物得到步骤1的雄性林麝粪便乙醇提取物中睾 酮含量的测定值
[0061]
[0062] 注：表中数据为3次重复试验的结果。
[0063] 使用SPSS16. 0软件对不同待测粪便乙醇提取物得到的雄性林麝粪便乙醇提取物 中睾酮含量的测定值进行单因素方差分析（one way-ANOVA)及多重比较，显著性水平设置 为P = 0. 05 ;结果如表4和表5所示。
[0064] 表4、单因素方差分析结果
[0065]
[0066] 表5、不同乙醇浓度与乙醇浓度为0的待测粪便乙醇提取物中睾酮含量测定值间 的差异显著性分析
[0067]
[0068] 结果显示，在乙醇体积百分比浓度大于等于7 %时，待测粪便乙醇提取物的睾酮 含量测定值出现波动，且与乙醇浓度为〇%时的测定值差异显著。表明当粪便乙醇提取物中 乙醇体积百分比浓度大于等于7 %时对酶联免疫反应测定睾酮含量的影响较大，当粪便乙 醇提取物中乙醇体积百分比浓度小于7 %时对酶联免疫反应测定睾酮含量的影响较小，可 将粪便乙醇提取物中乙醇体积百分比