一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物含量检测方法，尤其是一种丹参多酚酸注射液的含量检测方 法。
【背景技术】
[0002] 注射用丹参多酚酸是近几年开发的一种新型冻干粉针剂，主要组方为丹参多酚 酸，其配方和制备方法：丹参多酚酸加入甘露醇等辅料和注射用水，经活性炭除热原、微孔 滤膜过滤，再冷冻干燥而得，具有活血、化瘀、通脉之功，用于冠心病稳定型心绞痛，分级为 I、II级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸。
[0003]围绕注射用丹参多酚酸质量控制的研宄很多，测定其主要有效成分酚酸主要采用 C18色谱柱，由于甘露醇是一种六元醇极性化合物，不能采用常规的C18柱进行检测，所以 同时对制剂中主要有效成分和辅料的分析尚未见报道。
[0004]甘露醇为注射用丹参多酚酸的辅料，目前报道的甘露醇的测定方法有碘量法、紫 外-可见分光光度法、HPLC-RID和HPLC-ELSD法等。碘量法与紫外一可见分光光度法需要 经过化学反应，操作繁琐，难以直接测定甘露醇含量。HPLC-RID法示差折光检测器灵敏度 低，易受外界影响。HPLC-ELSD法较好，而甘露醇对色谱柱要求较高，C18柱对甘露醇不能检 测，普通色谱柱难以同时对其多酚酸及辅料甘露醇测定。且色谱法存在不同待测组分在检 测器上响应差异的问题，NMR是一种无偏向性的检测方法，可以解决这一问题。
[0005]定量质子核磁共振（quantitative proton nuclear magnetic resonance, qiH-NMR) 因其独特的优势而获得越来越多的关注，广泛应用于药物、食品、农业等领域，且我国2010 版药典将dH-NMR收载在附录中。c^H-NMR用于药物分析的最大优势在于可同时提供化合 物结构确证的定性信息和含量测定的定量信息。与HPLC方法相比，核磁共振法具有样品前 处理简单、谱图直观、耗时短等优点，能准确地检测出制剂中的有效成分和辅料，为中药注 射剂含量测定提供了一种新的手段。
[0006]中药注射剂在制备工艺上往往需要使用一些辅料，例如助溶剂、抗氧剂、pH调节 剂、等渗调节剂、膨松剂等。近年来中药注射剂安全问题层出不穷，辅料的安全问题日益受 到关注。本发明同时对注射用丹参多酚酸中的有效成分和辅料进行定性定量分析，对保证 制剂安全有效具有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题在于提供一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法，该 方法可以同时对丹参多酚酸注射液中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇的含量进行 检测。
[0008]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0009]一种丹参多酚酸注射液的含量检测方法，基于核磁共振法CH-NMR)对注射用丹参 多酚酸中的多种成分同时进行含量测定，具体步骤为：
[0010] ⑴内标溶液的配制
[0011] 称取1(2册04、似112?0 4与内标物TSP(3-三甲基硅基丙酸钠-d4)于容量瓶中，用 D20(重水）溶解并定容至刻度线，用于所有实验溶剂；
[0012] ⑵对照品洛液的制备
[0013] 分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇对照品，并分别制成相应的对 照品储备液；
[0014] (3)供试品溶液的制备
[0015] 精密称取注射用丹参多酚酸冻干粉并加入上述内标溶液中溶解，其中，每20mg丹 参多酚酸冻干粉加入lml内标溶液，得供试品溶液，将所述供试品溶液可转移至5_核磁管 中，直接用于 1H- NMR测试；
[0016] (4)屯-匪1?指纹图谱的测定
[0017] 将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定注射用丹参多酚酸样品 溶液的iH-NMR指纹图谱和对照品溶液的1H-NMR图谱，所有的一维屯-匪1?谱均在298K下采 集，脉冲序列zgcppr抑制水峰，谱宽设置为12335. 5Hz，弛豫延迟时间为20s确保所有信号 完全弛豫，采样点数32k，扫描次数：16次；
[0018] 为对其信号进行归属，测定指定样品的2D NMR谱，包括：$-屮COSY/H-1!! T0CSY，屯-13(： HSQC 和1H-13C HMBC 谱；
[0019] (5)样品1H-NMR图谱分析
[0020] 依据NMR谱及文献数据，鉴定迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、甘露醇，采用 MetresNova软件对得到的屯-匪1?指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标，并对其信号 进行归属；
[0021] (6)屯-匪1?多成分的含量测定
[0022] 在上述实验条件下采集图谱，对迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸和甘露醇以及内标物 TSP的定量峰分别进行积分，按照1H-NMR内标法根据积分结果依照下式计算样品的质量：
[0024] 其中，ATSP和A s分别是TSP甲基峰和化合物定量峰的积分面积，n TSP和n s分别代 表TSP甲基峰和化合物定量峰的质子个数，WTS^ W s分别是TSP和化合物的质量，M ^和M s 分别是TSP和化合物的分子量。
[0025] 优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤（1)中所述内标溶 液中含有 1. 5M K2HP04、1. 5M NaH2P04、0. 2mg/ml TSP。（例如，精密称取 K2HP043 . 48 36g、 似1^042.40018与内标物了5?(3-三甲基硅基丙酸钠-(1 4)2011^于1001111容量瓶中）。
[0026] 优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤（2)中迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B和甘露醇对照品分别制成相应的对照品溶液，方法如下：分别加所述内标溶液 制成质量浓度为1. 685、1. 235、16. 21、12. 54mg/ml的混合溶液，作为对照品储备液。
[0027] 优选的，上述丹参多酚酸注射液的含量检测方法，所述步骤（5)中迷迭香酸、丹酚 酸B、紫草酸、甘露醇的信号进行归属如下表1。
[0028]表1
[0029]
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 上述注射用丹参多酚酸的含量检测方法，由于供试品均为水溶性成分，故选择重 水为溶剂；实验发现溶液pH值对NMR图谱有影响，故配制成一定磷酸盐缓冲液，可以稳定 pH值；将制剂样品溶解于重水磷酸盐缓冲液中，不加其它任何处理，直接用于NMR测试，操 作简便，而且可以最大程度反映注射剂的真实组成。
[0033] 本发明所述方法可以有效解决丹参多酚酸及赋形剂甘露醇等成分的定量分析问 题，上述方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测 注射用丹参多酚酸质量方面具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0034] 图1为注射用丹参多酚酸样品的一维1H NMR谱，S 2. 5-4. 3和S 5. 7-7. 7部分分 别放大2倍、8倍，其中1是丹酚酸B，2是紫草酸，3是甘露醇，4是迷迭香酸；
[0035]图2为4种成分迷迭香酸（A)，紫草酸（B)，丹酚酸B (C)，甘露醇（D)用于含量测定 的定量峰图谱。
【具体实施方式】
[0036] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0037] 实施例1
[0038] 注射用丹参多酚酸1H-NMR标准指纹图谱的建立
[0039] 1. 1仪器与试药
[0040] BRUKER AVANCEIII 600型超导核磁共振波谱仪，质子激发频率600. 23MHz，配置 BBF0正相观察宽带探头。5mm标准核磁样品管（美国N0RELL公司）。METTLER TOLEDO XP6 天平（瑞士 METTLER公司）。
[0041] D20(氘代度>99.8%，美国N0RELL公司）；3-(三甲基甲硅烷）丙酸-d4钠盐 (TSP，氘代度>98%，美国Sigma-Aldrich公司）；迷迭香酸（批号wlO-5-3)、紫草酸（批号 W14-8-0)、丹酚酸B (批号W15-5-7)标准品均购自天津中新药业集团股份有限公司，纯度