筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及活性细菌的微生物筛选和进一步的活性成份筛选，特别涉及筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，主要是一种在纸上丝网套印包括样本细菌-模型细菌的对偶微室共同培养、分离成份部位-模型细菌的对偶微室、2-维电泳以及细菌呼吸电化学测量阵列等单元的纸基2-维电泳微流控芯片。
【背景技术】
[0002]1928年Alexander Fleming发现青霉素和抑菌环(A.Fleming, 1929，12，226-236)。12年后弗洛里和钱恩分离得到第一个临床应用抗生素青霉素。Lewis (K.Lewis, 2012, 485, 439-440)指出，在抗生素发现黄金时代(40?60年代)大多数抗生素从土壤源放线菌中被筛选出来，但该法收益递减，20年后这类方法和平台却不灵了，随后从合成化合物筛选，也因多数缺乏透过细菌包膜能力也努力失败。他强调思考抗菌发现的黄金时代，不要放弃过去成功的筛选土壤细菌的方法。
[0003]当前在环境污染抗性细菌普遍出现和繁衍的情况下，唯有采用现代先进技术才能保持我们期望的抗菌素耐药和新药发现的平衡，从而使往日成功得以复制。Kaeberlein等设计了一个模拟海洋沉积物在0.03 μ m孔径聚碳酸醋膜间形成微生物扩散生长室，来孵育不可培养的(野生)海洋微生物的自然生长(T.Kaeberlein etal.，2002，296，1127—1129) Jichols (D.Nichols et al.，2010，76，2445-2450)等使用一种新型隔离芯片，原位地、高通量地从不同环境中分离、并培养了 ‘野生’微生物物种。这种芯片包含数百个可接种单个细胞的微扩散室，形成庞大且多样的阵列排布，能够发现先前难以培养的微生物。Huacca等采用聚二甲基硅氧烷PDMS喷墨打印纸基便携装置来培养细菌(M.F.Huacca et al.，2012，12，4269-4278)。但是，这些芯片都没有包含阵列样本细菌-模型细菌对偶微室这样的活性细菌筛选单元，也不涉及活性细菌的次生代谢产物经过2-维分离后的阵列活性成份筛选单元。
[0004]目前，复杂抗生素样品(如细菌次级代谢物)通常采用毛细管电泳-质谱(P.1.Koczka et al.，2014，35，2534-2537)或液相色谱-质谱(M.Gbylik-Sikorska etal.，2015，119,8-15)分离检测；微流控芯片包括纸基微流控芯片(E.K.Sackmann etal.，2014，507，181-189)包含自动进样、样品预处理等多个功能也被广泛应用于复杂样品(如活性细菌次级代谢产物)的分离和检测；Shameli等基于2_维微流控芯片分离蛋白质并采用荧光标记蛋白进行检测(S.M.Shameli et al.，2015，87，3593-3597)。2007年Martinez等提出光刻法实现复杂图案的亲水区域和通道，并利用纸基自动虹吸输液的纸基微流控芯片(A.ff.Martinez et al.，2007，46，1318-1320)。其实，Gross 早在 1959 就采用2-维纸基平板电泳分离和苦味酸色包含至少27种氨基酸和酰胺的复杂生物样品(DK.D.Gross, 1959，184，1298-1301)。上述文献说明，2-维纸基平板电泳特别是具有相间电泳通道(有降低焦耳热的优点)的2-维垂直通道的纸基电泳芯片应该具有强大的分离复杂生物样品(如活性细菌次级代谢产物)的能力，但通过质谱、荧光标记蛋白或苦味酸染色检测等都不能直接地(原位地)筛选成份的活性。
[0005]纸基电化学传感器作为测向流动和微流控装置，其便宜、快速、灵活和容易使用在及时检测中得到越来越多的应用(B.W.Liu et al.，2014，26，1214-1223)。Wang等把大肠杆菌固定到普通碳电极，通过氢醌阳极电流指示毒物影响细菌呼吸程度(H.Wang etal.，2008, 19，211-214) ；Yu等在重金属毒物和苯醌溶液环境孵育大肠杆菌，用铂微电极工作电极-饱和KCl溶液Ag/AgCl参比电极-铂丝对电极反映毒物毒性的氢醌阳极电流(D.B.Yu et al.，2013，138，3297-3302)。
[0006]申请号为201410392974.9的中国发明专利，公开了一种纸基微流控芯片阳极电流检测水污染物生物毒性的方法，该方法基于微生物呼吸链-对氢醌体系电化学检测原理，在丝网印刷PDMS亲水微通道和碳浆三电极系统的纸基微流控芯片上，但是该专利不能用于筛选土壤活性细菌和成份，因此，必须发展高自动化程度、高通量、低成本、全程一体化的微流控平台技术，才能实现在污染抗性环境下土壤细菌新抗菌素的有效地筛选。
【发明内容】
[0007]针对污染土壤抗生素活性细菌和活性抗生素组份获取的难度大、概率低、费时费力的缺陷，本发明的目的在于提供一种筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备及应用，通过在色谱纸上多次套印细菌-明胶阵列培养、PDMS 2-维电泳、碳浆电泳电极和电化学三电极阵列单元得到纸基微流控芯片，再利用阵列对偶的样本细菌-模型细菌纸基微室共同培养筛选土壤样本抗生素活性细菌，再在利用2-维垂直通道的纸基电泳以及均匀分布在纸基2-维平面的分离成份部位-模型细菌的阵列微室，来原位地捕获或发现2-维分离的活性成份。
[0008]为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0009]筛选土壤活性细菌和成份的纸基微流控芯片制备，包括如下步骤:
[0010]步骤一、设计多功能纸基微流控芯片
[0011 ] (1.1)、设计第一维的等电聚焦电泳IEF分离通道2，该通道与左侧缓冲液池3和右侧缓冲液池4相连，在该通道左侧缓冲液池3的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26相连，再在该通道右侧缓冲液池4的纸基背面设计进样纸条25并与缓冲液26相连，并在该通道的左侧设计碳浆(+)电极5和右侧设计碳浆(_)电极6 ;
[0012](1.2)、设计纸基阵列活性细菌筛选功能单元1，该阵列功能单元紧邻IEF分离通道2上方，并沿该通道紧密地阵列分布；
[0013](1.3)、设计第二维的竖直、平行且间隔、阵列的毛细管区带电泳CZE分离通道7，该阵列通道位于第一维IEF分离通道2的下方，而且垂直并连接IEF分离通道2的不同位置，平行阵列CZE分离通道7的上方共用碳浆⑴电极8和下方的共用碳浆㈠电极9，在每个CZE通道7上方与IEF分离通道2垂直连接的纸基背面各个位置C1+，C2+，...处设计进样纸条25，进样纸条25并与缓冲液26相连，作为该阵列CZE的(+)极缓冲液池；同理，在CZE通道下方的纸基背面各个位置Cw C2_，...处也设计进样纸条25并与同样缓冲液26相连，作为该阵列CZE的(-)极缓冲液池10，以保证不同位置的已完成IEF第一维分离并分布于不同位置的活性细菌次生代谢物成份迅速进入邻近的相应CZE通道7，开始CZE第二维分离；
[0014](1.4)、设计纸基阵列活性成份筛选单元11，该功能单元是沿各阵列CZE分离通道7左侧最大紧密地阵列均匀排布的，在完成CZE活性细菌次生代谢产物第二维分离后，在2-维分离和模型细菌纸基层I的下层另外加一层模型细菌纸基层II，使得独立阵列模型细菌培养室15阵列分布于CZE分离通道7正下方，并通过紧密接触使对应位置的活性成份筛选单元11与CZE分离通道7导通，保证CZE分离通道7经2-维分离的、各个位置的次生代谢产物成份独立地扩散到其邻近的各个阵列活性成份筛选单元11里面；
[0015](1.5)、设计最下层的培养基-阵列电极纸基层III，该纸基层III包含着独立阵列的培养基供给单元，每个供给单元包括了直道的培养基供给通道12和弯道的培养基供给区13，以及处于纸基层I的模型细菌培养室14和纸基层II独立阵列模型细菌培养室15的碳楽.三电极结构单元16，楽三电极结构单元16与其上层的阵列活性细菌筛选功能单元I的位置相对应；
[0016]步骤二、制作多功能纸基微流控芯片
[0017](2.1)、丝网印刷碳浆电泳电极、PDMS活性细菌筛选功能单元、2-维分离通道和模型细菌，依据步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作IEF电极5、IEF电极6和CZE电极8,CZE电极9的丝网印刷网板A，在第一层色谱纸的正面丝网印刷这四个碳浆电泳电极，150°C烘I小时；再依据步骤(1.1)、步骤(1.2)和步骤(1.3)的设计制作阵列活性细菌筛选功能单元I中的模型细菌培养室14和样本细菌培养室17、IEF分离通道2、缓冲液池3、缓冲液池4、CZE分离通道7和缓冲液池10的网板B，再在第一层色谱纸的背面用质量比8:1的PDMS和正硅酸乙酯TEOS液态胶混合物丝网印刷，形成第一层色谱纸上包含正面的碳浆电泳电极、背面的细菌培养室和2-维分离通道层的结构，灭菌处理；再制作阵列活性细菌筛选功能单元I中的模型细菌培养室14构型的网板C，再在模型细菌培养室14内，在无菌环境下丝网套印