一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质组学研究方向磯酸化蛋白质组学技术领域，具体涉及应用于磯 酸化蛋白质组样品处理方法。
【背景技术】
[0002] 迄今为止，蛋白质磯酸化被发现是一种普遍发生的蛋白质翻译后修饰，它调控着 大约30%的真核细胞蛋白质组。作为一种重要的翻译后修饰，可逆的蛋白质磯酸化在细胞 代谢调节中发挥着重要的作用，例如细胞分化，细胞增殖，细胞调亡和信号传导等。各种各 样的胞内、胞外刺激都会引起细胞内磯酸化水平的非正常变化，而该恰恰是许许多多人类 疾病发生的诱因。因此，为了系统性地理解复杂多变的细胞行为，深入的研究磯酸化蛋白质 组已经成为了关键任务。最近，质谱技术在生物医学应用上的快速发展使得其已经成为了 磯酸化蛋白质组学研究的重要工具，仅仅单次的质谱鉴定分析就可W获得20, 000多磯酸 化位点的信息。
[0003] 对于磯酸化蛋白质组学研究而言，样品处理阶段是关乎下游质谱鉴定成功与 否的重要步骤。常用的样品处理方法的基本流程主要包括W下几步：细胞裂解，蛋白质 提取(包括可选的蛋白沉淀)，蛋白质酶解和磯酸肤的富集(文献1.A化叫uerque，C.P.et al.AMultidimensionalChromatographyTechnologyforIn-depthPhosphoproteome Analysis.Mol.Cell.Proteomics7, 1389-1396(2008).文献2.化ou,H.;化，M.etal.Robust phosphoproteomeenrichmentusingmonodispersemicrosphere-basedimmobilized titanium(IV)ionaffinityc虹omatography.P'Jat.Protoc. 8, 461-480(2013).)。如上步骤 通常都是需要各自独立完成，该就势必会导致样品处理阶段繁琐费力和低通量。因此，很有 必要发展一种快速高效的样品处理方法，W适用磯酸化蛋白组学的快速分析。
[0004] 许多研究都在致力于优化样品的前处理阶段，W适应高通量蛋白质组学研究 的要求，与此同时，该些年来，大多数的研究多关注的是较费时的蛋白酶解阶段。高压、 超声、微波、固定化酶和表面活性剂均被用来加速蛋白质的酶解(文献3. 01szowy，P. P. ,Burns,A.feCiborowski,P.S.Pressure-assistedsamplepreparationfor proteomicanalysis.Anal.Biochem.438,67-72 (2013).文献 4.Lopez-Ferrer,D. etal.UltraFastTrypsinDigestionofProteinsbyHighIntensity Focused叫trasound.J.ProteomeRes. 4, 1569-1574(2005).文献 5.Havli§,J.et al.Fast-ResponseProteomicsbyAcceleratedIn-GelDigestionofProteins. Anal.Qiem. 75, 1300-1306(2003).文献 6.Reddy,P.M.etal.DigestionCompleteness ofMicrowave-AssistedandConventionalTrypsin-CatalyzedReactions.J.Am. Soc.MassSpectrom.21,421-424(2010).文献 7.Dycka,F.etal.Rapidandefficient proteinenzymaticdigestion:Anexperimentalcomparison.J.Electrophoresis33, 28 8-295(2012).文献 8.Yu,Y.-Q.etal.Enzyme-Friendly,MassSpectrometry-Compatible SurfactantforIn-SolutionEnzymaticDigestionofProteins.Anal. 化em. 75, 6023-6028(2003).)。在众多的技术中，借助于高浓度的酶无疑是一种很直接的用 来缩短酶解时间的手段。曾有研究指出，使用越高比例的酶/蛋白比，蛋白水解的速度就会 越商（文献 9.Hustoft,比K.etal.Criticalassessmentofacceleratingtrypsination methods.J.化arm.Biomed.Anal. 56, 1069-1078 (2011) .)〇 但是，令人不甚满意的是，同样， 较多的自酶解肤段也会随之产生，该就给后续的质谱鉴定造成一定的困扰。因此，为了避免 膜酶自酶解现象的干扰，在蛋白质组学研究中，通常推荐使用酶/蛋白比例为1/25,该就意 味着酶解时间势必要加长至过夜酶解，W弥补酶解效率过低造成的酶解不足现象。但是， 固定化酶的使用却可W大大降低膜酶的自酶解程度，从而解决该一难题(文献10.Sun,L.et al.CouplingMethanolDenaturation,ImmobilizedTrypsinDigestion,andAccurate MassandTimeTaggingforLiquid-Chromatography-BasedShotgunProteomicsof LowNanogramAmountsofRAW264.7CellLysate.Anal.Qiem. 84, 8715-8721(2012).文 献ll.Li,D.etal.FunctionalizationStrategiesforProteaseImmobilizationon Ma即eticNanoparticles.4(1￥.化]1(31:.Mater. 20, 1767-1777(2010).)。由此可W发现，借由 高浓度酶促进蛋白酶解该一方法存在一定的可能性。尽管如此，固定化酶的使用仍然没有 趋于普遍化，该极有可能是因为操作的不便利性W及固定化酶表面较高的非特异性吸附性 能。而在磯酸化蛋白质组学分析中，必备的磯酸肤富集该一步骤的存在，使得高浓度膜蛋白 酶促进蛋白快速酶解该一思路成为可能。本发明首次利用该思路，借助于高浓度的膜蛋白 酶，将繁琐的样品处理过程中的细胞裂解、蛋白质提取和蛋白质酶解综合于一体，实现了细 胞裂解和蛋白酶解的相互促进，从而保证快速、高效、高通量的实现磯酸化蛋白质组学样品 的预处理。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速、高效、便利、高通量、集细胞裂解、蛋白质提取和 蛋白质酶解于一体的磯酸化蛋白质组样品快速处理方法。
[0006] 本发明提出的磯酸化蛋白质组样品快速处理方法，利用了高浓度膜蛋白酶可W同 时促进细胞裂解和蛋白酶解的该一深层机理，实现了短时间内的磯酸化蛋白质组学的快速 分析。
[0007] 具体步骤如下：
[0008] (1)将数量为10000-500000个的HeLa细胞样品加入50-100yL反应体系内；
[0009] (2)将上述步骤（1)得到的反应体系加入膜蛋白酶后在振荡器上润旋震荡至全部 细胞膜破碎；
[0010] (3)将上述步骤（2)中得到的混合物溶液放置于30-4(TC水浴超声器内超声赔育；
[0011] (4)在上述步骤（3)中通过离也机控制的、且填充了 800yg-2mg固定化金属铁离 子亲和色谱材料（Ti-IMC)的GELoaderTip枪头内进行磯酸肤富集，将所得磯酸化肤段放 入冻干机中设置温度为室温下冻干；得处理后的磯酸化蛋白质组样品。
[0012] 将上述步骤（4)中得到的磯酸化肤段复溶在lOOy L0. 1%体积浓度的甲酸中进行 RPLC-MS/MS分析。
[0013] 步骤（1)中所述的反应体系是细胞裂解-蛋白酶解的反应体系，细胞裂解-蛋白 酶解的反应体系是含有0. 5%-1. 0%体积分数己基苯基聚己二醇，5-lOmM二硫苏糖醇和磯酸 酶抑制剂的50-100mMTris-肥1 (抑7. 8-8. 5)缓冲溶液。
[0014] 所述反应体系中的磯酸酶抑制剂组成为0. 5-1. 5mM氣化轴和0. 5-1. 5mM正饥酸 轴，pH为 7. 8-8. 5。
[0015] 步骤（2)所述反应体系中的膜蛋白酶的浓度为25化g/ykl. 0yg/yL，
[0016] 步骤（3)超声赔育反应时间为25min-lh。
[0017] 步骤（4)离也机的离也力为1000g-3000g。
[0018] 所采用的富集方式是将Ti-IMAC富集材料填充至GELoaderTip枪头（Eppendcxrf GELoaderTip20yL)内，借用1000g-3000g离也力进行富集。
[0019] 将该样品处理方法应用于磯酸化蛋白质组学快速分析，可获取相应的磯酸肤和磯 酸化位点的鉴定结果，该结果可W用于翻译后修饰蛋白质组学分析。
[0020] 所述的磯酸化蛋白质组样品快速处理方法中，所用膜蛋白酶的浓度为3(K)ng/y以 所需要的反应时间为25min。
[002。 本发明的优点：
[0022] 该样品预处理方法具有明显的优点：简便，快速，高效，高通量；膜蛋白酶作为最 为常用的蛋白水解酶，通常的使用方法是在较低的酶/蛋白比例下，进行过夜酶解，之所W 选择该样一个公认的酶解反应条件，是考虑到越高的酶/蛋白比例，会导致越高概率的膜 蛋白酶自酶解现象的发生；但在本发明中我们却利用高浓度膜蛋白酶促进蛋白快速酶解该 一优势，同时又充分验证了高浓度的膜蛋白酶对后续的磯酸肤富集和串联质谱鉴定都无任 何不利影响；因此，利用本发明可W在短短的25min内就能实现从细胞样品到肤段混合物 的快速转变；并且将本发明用于磯酸化蛋白质组学上实际样品的快速分析，获得了相对对 照正常组较优的质谱鉴定覆盖率，证实了该发明的准确性和高效性。
【附图说明】
[0023] 下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0024] 图1为所述磯酸化蛋白质组样品快速处理方法的流程图。收集到的一定量的细胞 样品，放置于细胞裂解-蛋白酶解的反应体系中，在高膜蛋白酶浓度的反应条件下，借助于 超声辅助技术，同时进行细胞的裂解和蛋白质的快速酶解，待酶解完成后，利用装填有一定 量Ti-IMAC材料的离也器进行磯酸肤的富集，W备随后的质谱鉴定。
[00巧]图2为最优的裂解-酶解反应体系的考察情况，在五种不同的反应体系内，加入同 等量的细胞样品，并且同时保证其它反应条件完全相同的情况下，进行平行比较，由最终的 质谱数据，发现含有0. 8%NP-40的反应体系获得了最多数量的磯酸肤的鉴定，由此选择含 有0. 8%NP-4