检测细胞外生化参数的光电集成电位传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析细胞生理代谢的传感器技术领域，尤其涉及一种检测细胞外生化参数的光电集成电位传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002]活体细胞对外界刺激如药物、环境因素变化和受体作用等产生响应，会引起细胞代谢等功能性变化，外在表现为生化参数的改变。在分解代谢过程中，活体细胞将吸收代谢物质(糖、氨基酸、脂肪酸等碳源)，产生能量(ATP)并且释放出酸性产物。已有研宄证实酸化率(即H+浓度变化率)与细胞的生理状态密切相关。细胞胞外氧化还原电位(即细胞外微环境的氧化还原状态)，反应了自由电子的活性，与细胞的增殖、分化、凋亡及癌细胞侵蚀都有着密切的关系。
[0003]利用微型化电化学生物传感器，可以将细胞培养在传感器表面，细胞内的生理变化引起胞外环境的变化，胞外的电解质溶液与传感器之间形成电化学池，从而将这些参数的变化通过二级换能器转换为电信号输出，最终实现定量化监测和细胞水平的分析。
[0004]由于各种细胞生化参数检测的原理和技术的差异性较大，并且同时检测存在相互干扰的问题，目前成熟的技术仍以单一参数检测为主，例如基于光寻址电位传感器的胞外酸化率检测，具有特异性高灵敏度，已有非常成功的商业化产品，例如美国分子器件公司生产的微生理计。此外，主流的集成传感器仅对各个检测单元进行物理整合，各个单元的功能相互独立，制备过程复杂，通常体积较大，不易实现细胞水平的检测。再加之一些检测技术在安全性和小型化方面的局限性，限制了其在细胞检测方面的应用，例如胞外葡萄糖浓度的检测，常用技术为采用电流型葡萄糖传感器，需要在工作电极上施加一定的电压，对细胞造成不可避免的损伤，而采用传统的电位型传感器虽然可以避免施加电压，但其灵敏度和分辨率又无法达到细胞水平的测量要求；氧化还原电位检测通常采用传统大电极，其检测灵敏度较低，且体积大难以封装。
[0005]多参数联合检测有利于从多个角度反映细胞的生长代谢状况和对外界刺激的反应，目前还没有出现在同一个测试腔体中对细胞的能源消耗、代谢产物以及自由电子活性进行同时检测的技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测细胞外生化参数的光电集成电位传感器及其制备方法。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种检测细胞外生化参数的光电集成电位传感器，包括:传感芯片、芯片PCB板、外置导线、外置电极和细胞培养测试腔体。
[0008]所述传感芯片具有硅基底，硅基底背面具有三个光源照射窗口，三个光源照射窗口之间间隔至少1_，在硅基底正面与光源照射窗口相对应的位置分别设有第一敏感区域、第二敏感区域和第三敏感区域，在除第一敏感区域、第二敏感区域和第三敏感区域外的硅基底上表面通过离子注入或扩散形成重掺杂层，在硅基底正面覆盖薄氧化层，作为H+离子敏感材料；在薄氧化层表面第二敏感区域对应的位置覆盖第一金属层，作为氧化还原电位敏感材料；在薄氧化层表面第三敏感区域对应的位置覆盖复合膜，作为葡萄糖的敏感材料；所述复合膜由第二金属层上电镀聚吡咯和葡萄糖氧化酶的混合物形成；传感芯片边缘具有一焊盘，焊盘通过导线与第二金属层相连；第一金属层和复合膜的上表面、薄氧化层上第一敏感区域对应的位置以及焊盘均暴露于传感芯片表面，其他区域均覆盖Si3N4绝缘层；硅基底背面的非窗口区域覆盖铝电极；所述芯片PCB板上具有第一接口焊盘、第二接口焊盘、第一引线、第二引线、第一引脚和第二引脚，所述第一接口焊盘的形状和尺寸与传感芯片背面相同，并在光源照射窗口的相对应位置开有透光孔；第一接口焊盘通过第一引线与第一引脚相连，第二接口焊盘通过第二引线与第二引脚相连；第一引脚和第二引脚位于芯片PCB板的边缘；所述外置导线一端连接在传感芯片的焊盘上，另一端连接在第二接口焊盘上；所述细胞培养测试腔体的内侧壁开有凹槽，所述外置电极固定在凹槽内。
[0009]一种检测细胞外生化参数的光电集成电位传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)制备背面光源照射窗口:选择电阻率为8?10 Ω.Cm的P型硅片作为硅基底，清洗烘干之后，在硅基底背面旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀，蚀刻出光源照射窗口，光源照射窗口顶部的硅基底剩余厚度为100 μ m ;
[0011](2)制备重掺杂层:在1000°C高温扩散炉内，通干氧，硅基底正面热氧化生长一层厚氧化层，厚度800?lOOOnm，随后在厚氧化层上旋涂一层光刻胶，经紫外曝光显影，采用湿法腐蚀去除正面暴露的氧化层，然后采用离子注入或扩散法形成P+重掺杂层，与此同时，P+重掺杂层表面也会有少量氧化层形成；
[0012](3)制备H+离子敏感膜材料:采用湿法腐蚀将硅基底正面的氧化层全部去除，然后在芯片正面热氧化生长一层薄氧化层，厚度50nm ;
[0013](4)制备金属敏感膜材料:在薄氧化层表面旋涂光刻胶，经紫外曝光显影之后，磁控溅射20nm厚的钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射沉积一层金属层，厚度150?200nm，然后采用lift-off工艺将第二敏感区域、第三敏感区域、导线和焊盘以外的金属层进行剥离；
[0014](5)制备片上隔离区域:采用LPCVD法在硅基底正面沉积一层Si3N4绝缘层，厚度I μm，随后旋涂光刻胶，经紫外曝光显影，蚀刻第一敏感区域、第二敏感区域、第三敏感区域、焊盘表面覆盖的Si3N4绝缘层，而其他区域表面的Si 3N4绝缘层保留下来，作为片上隔离区域；
[0015](6)制备背面铝电极:硅基底背面热蒸发沉积金属铝，厚度300nm，并在铝层表面旋涂光刻胶，经曝光显影，蚀刻掉光源照射窗口表面的铝层，保留非窗口区域的铝电极；
[0016](7)传感器的封装:利用划片工艺将硅基底分割成IcmX Icm的小片，取出一小片，将背面铝电极涂上导电胶，并粘合在芯片PCB板上的第一接口焊盘处，放置于100 V的烘箱中固化I小时；将外置导线的一端焊接在第二接口焊盘上，将另一端涂上导电胶，粘合在传感芯片表面的焊盘上，放置于100°C的烘箱中固化I小时，使得第二金属层与第二引脚导通；然后将外置电极卡在凹槽内，再用环氧树脂胶水将细胞培养测试腔体封接在芯片PCB板上，并使得传感芯片暴露在细胞培养测试腔体内部；
[0017](8)制备复合膜:配制单体吡咯和葡萄糖氧化酶的混合溶液，吡咯单体浓度为0.1M，葡萄糖氧化酶浓度在20?300U/mL范围内，将混合溶液滴加到细胞培养测试腔体内，将第二金属层作为工作电极，第二引脚为工作电极的信号引出脚，Ag/AgCl作为参比电极，外置电极作为对电极，组成三电极体系，分别与恒电位/电流仪上的工作电极接口、参比电极接口、对电极接口相连，在工作电极上施加恒电流，电流密度为0.0lmA/cm2?1.0mA/cm2，电荷密度为10?40mC/cm2，单体吡咯发生聚合，并包埋葡萄糖氧化酶，在第二金属层表面即可形成复合膜，厚度小于lOOnm，随后采用pH7的磷酸盐缓冲液对传感芯片表面进行清洗，而后放置在4°C条件下干燥保存待用，得到光电集成电位传感器。
[0018]本发明的有益效果是:
[0019](I)本发明在硅基底的光寻址电位传感器表面沉积金属层，可以对氧化还原电位参数进行高灵敏度检测，体积小，易于封装，有利于细胞外自由电子活度的检测；
[0020](2)本发明结合MEMS工艺和电化学技术，在金属层表面电聚合修饰聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合膜，可以对葡萄糖浓度进行高灵敏度检测，并且测试无需施加工作电压，对细胞无刺激、无损伤，在不影响细胞正常生理活性的前提下实现能量消耗速率的检测；
[0021](3)本发明以光寻址电位传感器以基础，在其表面制备多种敏感膜，可实现胞外酸化率、胞外葡萄糖消耗速率、胞外氧化还原电位三个生化参数的同时检测，由于传感器