一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于代谢组学技术领域。具体设及一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方 法。
【背景技术】
[0002] 应激与断奶综合症等因素引起的仔猪肠道健康问题是导致仔猪死亡和养猪生产 效益下降的重要原因。仔猪消化不良会引起腹泻和细菌感染，并引起免疫力下降，发病率增 加，甚至死亡。由于饲料到达肠道后首先会经过肠道菌群的作用，所W肠道菌群在饲料消 化、吸收和代谢W及菌群代谢物在影响宿主代谢中均扮演着重要角色。肠道菌群作为定植 在肠道中的特殊群落和肠黏膜细胞一起参与日粮碳水化合物、氨基酸、脂质等营养物质的 代谢，对饲料营养物质的代谢和利用产生深远的影响。比如，肠道微生物对肠腔内尿素的水 解和对日粮氨基酸的脱氨基作用会导致用于体蛋白质合成和沉积的日粮氨基酸分解和损 失，特别是必需氨基酸。猪肠道微生物与黏膜对氨基酸的竞争利用并共代谢，肠道微生物和 肠黏膜的蛋白质周转迅速且量大。受日粮因素和肠黏膜分泌物的刺激，肠道微生物可通过 调节自身的基因表达和蛋白分泌，W适应肠道内环境2。肠道微生物可W代谢氨基酸产生氨 和其他氨基酸等代谢物，也能利用氨态氮合成氨基酸。因此，肠道微生物不仅对碳水化合物 代谢具有影响，而且可W调节宿主的氨基酸池和氮周转。
[0003] 随着代谢组学研究的不断深入和研究领域的不断拓展，肠道内容物代谢组学研究 也成为了目前代谢组学的热点应用领域之一。肠道内容物代谢组的研究方法，主要可W分 为菌群代谢足迹和代谢指纹的研究方法，菌群代谢足迹是对其微生物体外代谢产物的表征 和变化规律的研究，而代谢指纹是对其微生物体内所有代谢物的定性和定量研究，其关系 见图1所示。通过代谢指纹的表征可W得到微生物代谢的最直接证据，实时的反映其代谢 的过程和行为，而通过代谢足迹则可W得知其代谢的结果，而且往往代谢足迹有蓄积的作 用，该样就可W放大代谢指纹的结果，更加利于检测和表征。
[0004] 目前关于肠道内容物代谢组的研究刚刚起步，尚有许多方法学的问题有待解决。 一方面，不同肠段的抑值变化非常大，成年猪胃内容物的抑值在2. 0-3. 5之间、空肠和回 肠抑值在6. 0-7. 5、盲肠抑值在4. 5-6. 0之间、结肠和直肠抑值在5. 0-8. 0之间。内容物 从胃到直肠被排出体外，抑值也从2变化到8左右。该主要与内容物中酸性和碱性物质组 成和比例相关。此外，pH值还会随着摄入食物的组成和胃肠道状态而出现变化。所W，胃 肠道内容物的抑值可能存在从2到8的一段较大的动态范围。而内容物中的不同成分，对 抑值的反应也会不同，该对内容物中化合物的提取造成了较大影响。并且基于NMR的代谢 组学分析方法中，NMR检测对抑值有着严格要求，因为抑值对化学物质的化学位移有着大 的影响。所从对于基于NMR的代谢组学研究中，找到针对于胃肠道内容物合适的抑值是 十分必要的。其次，胃肠道内容物组成研究中，最为普遍的方法是氨基酸和短链脂肪酸的检 测方法。由于进行氨基酸检测时，需要高温mere)和强酸条件下消解6,无法保留肠道内 容物的原貌，特别是短链脂肪酸。而短链脂肪酸的检测方法也不能检测氨基酸等其他的化 合物。肠道菌群除了产生甲酸、己酸、丙酸和了酸等短链脂肪酸外，还会产生其他重要的代 谢物。比如，采用氯仿、甲醇和水提取法提取到枯草杆菌包括糖酵解和=駿酸循环代谢物的 上百种物质。
[0005] 因此，由于代谢组学分析需要保持代谢物的原貌而且力图检测到尽量多的代谢 物，该就需要对目前存在的提取方法进行筛选和优化，避免温度过高、操作过于繁琐和提取 效率较低的提取方法，进而找到适合于胃肠道内容物代谢组学分析的提取方法。
[0006] 现有尹富贵等采用的肠道内容物氨基酸提取方法：称取冻干回肠末端内容物 0. 5g置于安培瓶中，加入6mol/L盐酸10ml后混匀，密封。110°C消化2化，定容至100ml， 吸取2ml经0. 25m微孔滤膜过滤，用k8800型全自动氨基酸分析仪测定15种氨基酸（Phe、 Tyr、Leu、116、￥31、413、617、43口、6111、切3、化3、1^73、4巧、1'虹和561')的含量，然后乘!^稀 释倍数换算成内容物中氨基酸的含量。其缺点是采用浓硫酸和硝酸高温消解肠道内容物蛋 白质和氨基酸，具有耗时，环境污染大等缺点。
[0007] 现有肠道内容物短链脂肪酸提取方法：高增兵等取盲肠内容物3g，用蒸馈水进行 稀释（质量体积比1 ;1)，振荡混匀至无明显结块的悬浮状。500Xg离屯、lOmin，取上清 液2血至新EP管中，12000Xg离屯、lOmin，取上清液1血，加入25 %的偏磯酸0. 2血，充分 混匀，静置30min后12000Xg离屯、lOmin，取上清液100^以加入甲醇100^以充分混匀 并12000Xg离屯、lOmin，收集上清液于EP管中，-20°C冰箱保存待测。采用气相色谱仪 (VARIANCP-3800,美国）测定己酸、丙酸、了酸浓度进行。其缺点是采用偏磯酸和甲醇提取 短链脂肪酸，操作较为繁琐，具有耗时较长，环境污染大等缺点。而且只能检测到3种短链 脂肪酸。
[000引另外，李春慧等称量解冻的盲肠内容物2g，加入蒸馈水10血，4°C浸泡4她；然后 4°C，500化/min离屯、lOmin，取上清液1血，加入25 %的偏磯酸去蛋白溶液0. 2血，混匀，冰浴 30minW上；冰浴后，立即4°C，lOOOOr/min离屯、lOmin，取上清液备用。用微量移液枪吸取 0. 6UL待测液进样，采用气相色谱测定己酸、丙酸、了酸、异了酸、戊酸、异戊酸和总VFA的 含量。其缺点是提取程序耗时较长。虽然可W同时测定己酸、丙酸、了酸、异了酸、戊酸、异 戊酸的浓度，但由于仅仅针对性检测短链脂肪酸，不能同时检测氨基酸W及其他的化合物。
【发明内容】
[0009] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法。
[0010] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0011] 所述猪胃肠道内容物代谢组学提取方法包括如下步骤：
[0012] (1)用1M化OH溶液和1M肥1溶液将解冻的猪胃肠道内容物的抑值调整到2.0- 12.0,优选为8.0;
[0013] (2)取猪胃肠道内容物加入0. 1M或1M的磯酸盐缓冲液中，猪胃肠道内容物与磯酸 盐缓冲液的质量体积比为1:20至1:2,优选为1:10,质量体积比的单位为g/mU经液氮速冻 后，于水浴锅中超声解冻，然后置于组织破碎仪中破碎；将破碎后的猪胃肠道内容物再重复 液氮速冻、超声解冻、破碎仪破碎处理2-3次，优选2次；
[0014] 做将经步骤似处理后的猪胃肠道内容物于4°C、12000巧m离心取上清液，取上 清液0.6血加入5mm核磁管待检，上清液即为猪胃肠道内容物的提取物。
[001引优选地，内容物提取过程于冰上（0-4°C)或室温（25°C)条件下操作。
[0016] 优选地，用水配制步骤（2)所述的磯酸盐缓冲液，所用的水中重水含量为10-100%，优选100%，所用TSP内标浓度为0.005-0. 1%，优选0.01%，配制后的磯酸盐缓冲 液的抑值为7.0-8.0,优选8.0。
[0017] 优选地，用甲醇和水混合溶液配制步骤（2)所述的磯酸盐缓冲液，所用TSP内标浓 度为0. 005-0. 1 %，优选0. 01 %，配制后的磯酸盐缓冲液的抑值为7. 0-8. 0,优选8. 0。
[0018] 优选地，用己膳和水混合溶液配制步骤（2)所述的磯酸盐缓冲液，所用TSP内标浓 度为0. 005-0. 1 %，优选0. 01 %，配制后的磯酸盐缓冲液的抑值为7. 0-8. 0,优选8. 0。
[0019] 本发明所述的提取方法是抑值校正后磯酸盐缓冲液提取新方法，不仅保证了胃 肠道内容代谢物组成的原貌，将核磁谱峰漂移减小到最低程度，提高了核磁谱图的质量，同 时简化了提取工艺流程。通过对提取工艺流程的优化，方法如下；称量解冻的胃肠道内容 物Ig采用1M化OH溶液和1M肥1溶液将抑值调整到8.0,然后称取0.Ig混匀的内容物 (冰上操作，W保证在0-4°C)，加入0. 1M磯酸盐缓冲液（抑值8. 0,0.01%TSP，100 %重 水）1.OmU液氮速冻后，水浴锅中超声并解冻后，置于组织破碎仪中（20化，30s)，如此反复 冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4°C，12000巧m离屯、lOmin，取上清液0.6血加入5mm 核磁管备用。可检测代谢物51种，其中氨基酸20种，短链脂肪酸7种，=駿酸循环代谢物 5种，其他代谢物19种，整个提取过程仅需化。谱峰漂移受抑值影响很小。因此，该提取 方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程，实现了内 容物中代谢物的全谱检测。
[0020] 现有技术包括氨基酸提取工艺、短链脂肪酸提取工艺等，提取操作程序复杂，耗时 较长，由于使用大量有机溶剂，成本高，环境污染较大，也无法实现内容物所有组分的同时 检测。为了在既保证猪胃肠道内容物提取率的前提下，又最大程度的简化提取工艺，降低提 取成本。本发明直接采用磯酸盐缓冲液提取法替代盐酸消解和偏磯酸提取法，同时简化提 取流程，尽量减少操作对实验结果的影响，保持内容物代谢物组成的原貌。并在样品提取前 对抑值进行校正，W保证核磁谱峰漂移最小，最终达到既保证水溶性代谢物的提取效率最 高，又能明显改善核磁谱峰的质量，为胃肠道内容物代谢组学研究提供新的样品提取方案。
【附图说明】
[0021] 图1为肠道菌群代谢指纹与代谢足迹的代谢组学研究方法示意图；
[0022] 图2为NMR谱积分后主成分分析的得分图，箭头代表样品点在得分图上的分布变 化，楠圆形框则代表出现2个明显聚类，即抑值7. 0到抑值8. 5和抑值10. 0到抑值 12. 0 ;
[0023] 图3为提取磯酸盐缓冲液中重水含量为5%、10%、50%和100%的压水峰核磁谱 图（①为5 %重水，②为10 %重水，⑨为50 %重水，④为100 %重水）；
[0024] 图4为提取缓冲液中TSP浓度0. 005、0. 01、0. 05到0. 1 %的TSP谱峰（①为 0. 005%，②为 0.01%，⑨为 0.05%，④为 0.1%);
[0025] 图5为提取缓冲液中TSP浓度为0. 1 %的TSP谱峰；
[0026] 图6为不同提取温度NMR谱积分后主成分分析的得分图（□表示在冰上（0-4°C) 提取样品，▲代表在室温（25°C)提取样品）；
[0027] 图7仔猪盲肠内容物NMR谱图；检测到代谢物包括；1，甲酸；2,己酸；3,丙酸；4， 了酸成a-酬甲基-正戊酸；6,酬异己酸；7,酬异己酸；8,异亮氨酸；9,亮氨酸；10,鄉 氨酸；11，丙氨酸；12,苏氨酸；13,赖氨酸；14,脈氨酸；15,精氨酸；16,脯氨酸；17,谷氨 酸；18,谷氨酷胺；19,蛋氨酸；20,甘氨酸；21，天冬氨酸；22,天冬氨酷；23,酪氨酸；24， 色氨酸；25,苯丙氨酸；26,组氨酸；27,牛横酸；28,S甲胺；29,肌酸；30,肌酢；31，胆碱； 32,甲醇；33,a-木糖；34,尿喀晚