一种检测疯草提取物和胶囊中苦马豆素含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分析化学技术领域，具体是一种检测疯草提取物和胶囊中苦马豆素含量 的方法。
【背景技术】
[0002] 疯草（Locoweed)是豆科棘豆属（Oxytropis)和黄巧属（Astragalas)有毒植物的 总称，是我国和美国西部分布最广的有毒植物之一。据不完全统计，我国现有疯草44种（其 中紫云英属21种，棘豆属23种），构成严重危害的有15种（其中紫云英属6种，棘豆属9 种），主要分布于陕西、甘肃、青海、西藏、新疆、内蒙古、山西、宁夏、四川等省区。疯草危害食 草动物的安全，家畜采食疯草后，可导致疯草中毒综合症。
[0003] 苦马豆素（swainsonine，SW)是引起疯草中毒的主要毒性成分，1979年澳大利亚 学者Colegate首先从灰苦马豆（Swainsonacanecens)中分离到SW。随着研究的深入和扩 展，人们发现苦马豆素可作为免疫调节剂、肿瘤转移和扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等 药物使用，苦马豆素还可W促进骨髓增殖，能有效递转致死性福照或高剂量化疗所造成的 骨髓抑制及随后发生的嗜中性白细胞减少症，并初步证明苦马豆素对人的恶性肿瘤有治疗 作用。传统抗癌药在发挥药效的同时会对机体造成免疫损伤，但SW却能刺激机体骨髓细胞 增殖，增强机体免疫力，因此具有更广阔的医用前景，可产生巨大的经济效益和生态效益。
[0004] 2006年，第四军医大学天然药物研究所与杨凌天力生物科技有限公司合作，凭借 雄厚的科技力量和尖端的科研设备开发完成了苦马豆素抗癌新药的临床前药学、药理研究 和抗福射试验，对苦马豆素药物活性进行了大量的基础研究，最后成功研制成医院制剂"棘 豆扶正胶囊"，并获得解放军第四军医大学制剂批号；兰制字（2006)F68104。棘豆扶正胶 囊是一新型抗肿瘤中药，主要成分为棘豆中的有效单体一苦马豆素，用于抗癌、抑制肿瘤生 长，在第四军医大学第一附属医院临床应用多年来收到较好的治疗效果。
[0005] 目前，疯草提取物中苦马豆素的检测方法有薄层色谱法（TLC)、气相色谱法（GC) 和高效液相色谱法（HPLC)。薄层色谱法检测方法简单快捷，易于操作，但是用作定量检测时 误差却较大，不适用于精确测量。气相色谱法检测限低，定量准确，但在检测时，需制备易升 华且稳定的苦马豆素衍生物，增加了样品处理的难度，也增加了检测结果的不确定度。高效 液相色谱法由于苦马豆素水溶性很强，且缺乏适合分光光度法检测的发色基团，所W检测 限偏高，不适用于药物分析。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、准确 的检测疯草提取物和胶囊中苦马豆素含量的方法。
[0007] 实现上述发明目的的技术方案是；一种检测疯草提取物和胶囊中苦马豆素含量的 方法包括下列步骤：
[000引 1)采用体积比1%的甲酸甲醇溶液浸泡提取出疯草提取物或胶囊中的苦马豆素。
[0009] 2)采用石墨化碳固相萃取柱和针式过滤器净化处理提取液；
[0010] 3)采用液相色谱-质谱联用仪分离检测苦马豆素；
[0011] 4)W不同浓度苦马豆素与对应的响应峰面积作图，得到苦马豆素的标准曲线。将 待测样品峰面积对照标准曲线计算其苦马豆素含量。
[0012] 本发明所述的甲酸甲醇溶液浸泡提取出的疯草提取物或胶囊中的苦马豆素，具体 步骤是：
[001引1)疯草提取物样品：精密称取0.001~0.050g的疯草提取物样品加入10~100血 1%甲酸甲醇溶液溶解，振摇超声后，视样液中苦马豆素浓度用甲醇稀释至标准曲线范围， 过0. 22um有机系针式过滤器净化，上机测定。
[0014] 2)胶囊样品；将胶囊内容物混匀，准确称取0. 10~2.OOg内容物加入10~100血 1 %甲酸甲醇溶液，振摇超声后离屯、，400化'mirTi，lOmin。取上清液用石墨化碳固相萃取柱 和针式过滤器净化处理。
[0015] 本发明所述的采用石墨化碳固相萃取柱和针式过滤器净化处理提取液，具体步骤 是：
[0016] 石墨化碳固相萃取柱在使用前依次用5~15mL水、1%甲酸甲醇溶液活化。取提取 样液加入已活化的石墨化碳固相萃取柱，弃去前1~2mU收集随后滤液1~2mU过0. 22um 有机系针式过滤器净化后上机测定。
[0017] 本发明采用色谱柱是C18液相色谱柱。
[001引本发明所采用的化学试剂均为色谱纯，实验用水满足GB/T6682-2008中实验室用 水一级水要求。
[0019] 本发明所采用的液相色谱条件为：
[0020] 进样量5~20uL;柱温30~40°C;流动相梯度洗脱程序见表1。
[0021] 表1流动相梯度程序
[0022]
[0024] 本发明所采用的质谱条件为：
[002引离子源；ESr;检测方式；MRM;电喷雾电压；4. 0~6.化V;气帘气流量；5~ 20L?h4;喷雾气流量；40~80L?trS辅助加热气流量；40~80L?trS离子化电压；25~ 50v;离子源温度；500~600°C;碰撞气流量；1. 0~10. 0血?min-i;碰撞能量；20~50ev; 定量离子对；174/156 ;定性离子对；174/138。
[0026] 经HPLC-MS分析，苦马豆素在色谱上的保留时间为1. 0~2.Omin。
[0027] 采用本发明测定疯草提取物及胶囊中苦马豆素的含量，线性范围0.5~ 50. 0yg. [1，相关系数r= 0. 9994,最低定量限（LOQ) = 0.lug? [1，峰面积的重现性 巧SDs，n= 10) = 2. 61%，保留时间的重现性巧SDt，n= 10) = 0. 61%。加标回收率 92. 40~96. 61 %。液相色谱-质谱联用仪（HPLC-M巧由于其超高灵敏度，可避免绝大部分 的基质干扰，相比于其他检测方法前处理过程更加方便快捷，检测结果准确可靠。该方法灵 敏度高，专属性强，重现性好，分析方法可靠。
【附图说明】
[002引图1是苦马豆素标准曲线。
[0029] 图2是疯草提取物样品色谱图，图3是胶囊样品色谱图。