一种蛋白质快速荧光标记的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术，具体是一种蛋白质快速荧光标记的方法。
【背景技术】
[0002] 活细胞水平上对目的蛋白质的荧光标记是研宄目的蛋白质活动和特性的重要手 段，GFP(GreenFluorescentProtein，绿色焚光蛋白）及其衍生物被广泛的应用于活细胞 荧光显微成像。通常采取的策略是将全长的GFP融合到目的蛋白质的N-末端或者C-末端， 以达到引入荧光标记的目的。但是对于很多特定的蛋白质而言，GFP融合于其中往往会导 致其结构和功能遭到破坏或者GFP本身难以正确折叠，从而影响了对目的蛋白的研宄。另 一方面，通过将全长的GFP融合于目的蛋白引入荧光标记，GFP往往需要一个成熟的过程， 这影响了对目的蛋白的实时监测。
[0003] Split-GFP是将GFP切开后分别融合于目的蛋白，利用GFP分开部分能自发结合的 性质从而引入荧光标记。目前对于split-GFP的应用主要是将超折叠GFP上的末端的一条 0-strand切下，或者借助circularpermutation的手段将另外10条0-strand中的一条 切下，然后融合表达在所要研宄的目标蛋白的C-末端，通过加入体外制备的GFP1-10而引 入荧光，以此来尽量的减小荧光标记对所研宄系统的干扰。这限制了荧光标记的位置只能 是目的蛋白的N-末端或者C-末端。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种可在蛋白质任何一个loop区中引入荧光标记的蛋白 质快速荧光标记的方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] -种对蛋白质进行快速荧光标记的方法，将一段能与GFP帽子探针特异性结合的 小肽GFP10-11融合于目的蛋白的loop区中，融合表达后加入体外制备的可溶的GFP帽子 探针，GFP帽子探针即为GFP1-9探针，通过GFP1-9探针与小肽GFP10-11非共价作用特异 性结合；结合后产生荧光，从而引入荧光标记，小肽GFP10-11的氨基酸序列如序列表中的 序列2所示。
[0007] 作为本发明进一步的方案：所述GFP1-9探针的制备方法：GFP1-9探针是由氨基酸 序列如序列表中的序列1所示的绿色荧光蛋白经过分子生物学酶酶切而制备得到，酶切后 得到的GFP1-9探针的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0008] 作为本发明进一步的方案：还能用于在细胞表面对蛋白质进行快速荧光标记。
[0009] 作为本发明进一步的方案：用于细胞表面蛋白的表达水平的定量，用于示踪细胞 表面蛋白的内化和多聚化，用于筛选细胞表面蛋白内化和多聚化相关的药物。
[0010] 作为本发明进一步的方案：所述序列还包括其衍生和/或突变序列。
[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了该荧光标记的方法，GFP1-9 探针的制备方法，以及在溶液和细胞中的一般蛋白质荧光标记的方法。该荧光标记方法的 特点有：（1)特异性高，且基本无背景荧光。GFP1-9探针本身基本不能被激发出荧光，只有GFP1-9探针与GFP10-11特异性结合后才能产生荧光；（2)使用方便，标记前后不需要反复 洗掉多余探针，只需直接加入即可，而且可在一般的盐溶液中反应，无需特殊条件；（3)结 合速度快，lOmin内可完成结合并可激发出荧光，能够实现快速的标记；(4)其激发波长峰 值为482nm左右，发生波长峰值为507nm左右，与绿色荧光蛋白（GFP)基本一致，可采用常 规的荧光显微镜、荧光光谱仪检测。可以实现荧光标记时间的控制，标记浓度的控制，而且， 该荧光标记方法可以尽可能的减小对目的蛋白结构和功能的影响。该方法另一大优势是可 特异性的标记细胞表面蛋白，实现对细胞表面蛋白的定量以及示踪。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的探针用于在泛素中引入荧光标记的荧光光谱图；
[0013] 图2是本发明的标记方法应用于一种G蛋白偶联受体GPR17的细胞外区域引入荧 光标记图。
【具体实施方式】
[0014] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0015] 实施例1
[0016] 该标记方法在溶液中可溶性蛋白质上的应用
[0017] a、在大肠杆囷中表达的绿色灰光蛋白如序列表中的序列1所不；表达囷种： BL21*(DE3)，载体：pET-15b。在 37°C摇至 0D= 0.8,加入ImMIPTG，37°C诱导 4h。高速离 心收菌；
[0018]b、用NiA缓冲液重悬菌体后高压裂菌，，其中NiA缓冲液包括20mM三羟甲基氨 基甲烧（简称为Tris)与200mMNaCl，pH为8. 0。高速离心收集上清，过Ni柱，以60mL到 200mM咪唑梯度洗脱。收集组分用超滤管浓缩换NiA缓冲液至QA缓冲液，其中QA缓冲 液包括20mM三羟甲基氨基甲烷，pH为8. 0。过GE公司的SourceQ柱，梯度80mL-30%Q B缓冲液，其中QB缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1MNaCl，且其pH为8. 0 ;收集对 应组分；
[0019]c、过完SourceQ柱后的样品脱盐至GE公司的苯甲脒亲和层析柱中的上样缓冲 液，其中上样缓冲液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与500mMNaCl，其pH为7. 4 ;即胰酶酶切 缓冲液。50yM的sfGFP样品加入10U/mL的胰酶酶切缓冲液，在37°C下酶切0. 5h。过苯 甲脒亲和层析柱，收集流出液，用超滤管换成QA缓冲液，其中QA缓冲液包括20mM三羟甲 基氨基甲烷，且其pH为8.0。过SourceQ柱，梯度60mL-20%QB缓冲液，其中QB缓冲 液包括20mM三羟甲基氨基甲烷与1MNaCl，且pH为8. 0 ;收集洗脱组分，加入盐酸胍固体至 盐酸胍在溶液中的终浓度为4M，在4°C下放置2h，过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100 色谱柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、300mMNaCl与3MGdHCl，且pH为8. 0 ;收 集组分，浓缩至约5mL，过夜透析，过夜透析时的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、lOOmM NaCl与体积分数为10%的甘油，且pH为8. 0 ;过分子筛S100色谱柱，其中分子筛S100色谱 柱的缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷、100mMNaCl与质量分数为10%的甘油，且pH为 8. 0 ;得到GFP1-9,收集后浓缩，分装保存；
[0020] d、GFP10-11在泛素中的插入：通过聚合酶链式反应在泛素的Leu8和Lys9两 个氨基酸之间插入小肽GFP10-11对应的DN