用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药及保健品质量检测体系，具体涉及用于测定中药及保健品中非法 添加物质的方法。
【背景技术】
[0002] 高血压和糖尿病是常见病、多发病，其发病率随着人民生活水平的提高、生活方式 的改变及年龄结构的老龄化而迅速增加，已经严重威胁到人类健康。近年来，一些不法厂商 在利益的驱动下，利用人们相信中药和保健品是纯天然无毒副产品，可以长期服用的心理， 在中药制剂或保健食品中非法添加各种降压降糖化学药物，不仅严重影响了中药和保健食 品声誉，而且危及消费者的身体健康。
[0003] 现有的检测降糖降压药物的检测方法通常都是仅采用MRM的检测方法检测，得到 定量的结果，避免不了假阳性结果的出现；而且如果需要定性检测的话，需要使用其它的高 分辨质谱辅助二次检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于测定中药及保健品中非法添 加物质的方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 用于测定中药及保健品中非法添加物质的方法，包括以下方法：
[0007] (1)采用有机溶剂提取方法对待测中药或保健品样品进行预处理；
[0008] (2)通过液相色谱-四级杆串联线性离子阱质谱法，采用多反应监测一信息依赖 性采集一增强子离子扫描检测技术同时定性和定量检测经预处理后的中药及保健品中一 种或多种非法添加物质。
[0009] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述非法添加物质为13种降糖或降压类化 学药物，分别为：盐酸可乐定、阿替洛尔、硝苯地平、盐酸哌唑嗪、格列齐特、格列苯脲、格列 吡嗪、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、马来酸罗格列酮、盐酸吡格列酮、盐酸苯乙双胍和盐酸二甲双 狐。
[0010] 根据本发明的一个优选的实施方式，步骤（1)中样品预处理方法：将中药制品或 保健品与乙腈混匀，超声提取，取出后放置到室温，加入乙腈定容，然后进滤膜过滤后，得到 待测样品。
[0011] 本发明样品通过乙腈提取，操作方法简单，直接进样检测，即可快速得到结果，不 仅节省了样品前处理的时间，而且避免了样品在前处理过程中的损失，且样品的回收率较 好。
[0012] 其中，定容后，所述中药制品或保健品与乙腈的添加比例为：(0. 2~0. 5)g: (45~ 50)mL。经过大量实验验证，上述比例的待测物质的提取效果最好，比值较大的话，待测药物 提取不完全。
[0013] 所述中药制品或保健品若为固体，研成粉末状；若为液体，直接取样。
[0014] 所述超声时间为15~30min，优选为20min，超声温度为20~35°C，优选室温。
[0015] 所述滤膜的孔径为0? 20~0? 25ym，优选0? 22ym。
[0016] 超声波提取是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分 子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分。利用超声波技术来强化提取分离 过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本。上述超声条件经过实验验证使提 取分离率最高。经过实验分析，所述滤膜的孔径为〇. 20~0. 25 ym，滤膜过滤除去杂质，以 免影响检测结果的准确性。
[0017] 根据本发明的一个优选的实施方式，步骤（2)中液相色谱-四级杆串联线性离子 阱质谱法的色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱（C18柱），流动相由A相和B相组成，A 相为体积分数为〇. 1 %甲酸的水溶液，B相为乙腈，采用梯度洗脱。
[0018] 优选的，所述C18柱的粒径1. 7~2. 5 y m，柱内径为2. 2~4. 6mm，柱长为50~ 80mm，更优选为 ZORBAX Eclipse XDB-C18,4. 6mmX50mm，1. 8 ym ;优选流速为 0? 2~0? 4mL/ min，更优选的为0. 4mL/min ;优选柱温32~37°C，更优选为35°C ;进样量：5. 00 y L。
[0019] 优选的，梯度洗脱程序：0~2min，B相保持10%;2~8min，B相从10%升至80%; 8 ~lOmin，B 相保持 80% ;10. lmin_15min，B 相降至 10% ;15min 后停止。
[0020] 根据本发明的一个优选的实施方式，步骤（2)中液相色谱-四级杆串联线性离子 阱质谱法的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（+ESI)，采用正离子模式检测；干燥气：N2， 碰撞气：高纯氮气；气帘气压力：35.0psi，喷撞气模式：Medium，离子化电压：5500V，雾化 器温度：550°C，喷雾器压力：50.0psi，辅助气压力：50.0psi ;采用多反应监测模式（MRM模 式）。
[0021] 根据本发明的一个优选的实施方式，步骤（2)中信息依赖性采集一增强子离子 扫描条件为：IDA参数设置：采集阈值3000cps，勾选动态背景扣除；EPI参数：扫描速率 10000Da/s，扫描质量数范围m/z: 50-500,碰撞能量35eV，扩展碰撞能量15eV。然后将在线 采集到的13种化合物EPI谱图与标准EPI谱图进行在线比对，确定13种化合物是否出现 假阳性结果，实现定性检测。
[0022] 本发明方法还包括用各种非法添加的降糖或降压药物的标准品绘制标准曲线，并 由此计算待测中药或保健品中非法添加的物质的含量。具体方法是：
[0023] 取13种化学药物的对照品储备液，配制一系列不同质量浓度的混合标准液，于上 述条件和设定的13种降糖或降压类化学药物的质谱参数下分别进样测定，以各物质定量 离子峰面积的平均值（Y)与被测组分的质量浓度（X，mg/mL)进行回归，得到线性方程、相关 系数和线性范围。
[0024] 将待测样品，进样测定；用线性方程对样品进行定量，样品中的13种物质的响应 值应在仪器检测的线性范围内，实现定量检测。
[0025] 本发明的一种特别优选的实施方式，包括以下方法：
[0026] (1)方法：采用高效液相色谱-四级杆串联线性离子阱质谱联用仪（HPLC-MS/MS)
[0027] (2)高效液相色谱HPLC条件：
[0028] 色谱柱：Z0RBAXEclipseXDB-C18,4. 6mmX50mm，1. 8ym;
[0029] 流动相：A相为体积分数为0. 1 %甲酸的水溶液，B相为乙腈；
[0030] 梯度洗脱程序：0~21^11，8相保持10%;2~8111111，8相从10%升至80% ;8~ lOmin，B 相保持 80% ;10. lmin_15min，B 相降至 10% ;15min 后停止；
[0031] 流速：0? 4mL/min ；
[0032] 柱温：35°C ;
[0033] 进样量：5.00yL;
[0034] (3)多反应监测模式（MRM)定量检测条件：
[0035] 离子源：电喷雾离子源（+ESI)，采用正离子模式检测；
[0036] 干燥气：N2，碰撞气：高纯氮气；
[0037] 气帘气压力：35. Opsi，喷撞气模式：Medium，离子化电压：5500V，雾化器温度： 550°C，喷雾器压力：50.0psi，辅助气压力：50.0psi ;采用多反应监测模式（MRM模式）；
[0038] (4)信息依赖性采集一增强子离子扫描（IDA-EPI)定性检测条件
[0039] 本方法在定量检测13种降糖降压类化学药物的同时，利用打开IDA-EPI模式，对 所定量的目标化合物进行"信息依赖性采集一增强子离子扫描"，与目标化合物的标准EPI 谱库进行比对，排除样品中可能出现的假阳性结果。
[0040] IDA参数设置：采集阈值3000cps，勾选动态背景扣除；EPI参数：扫描速率 10000Da/s，扫描质量数范围m/z: 50-500,碰撞能量35eV，扩展碰撞能量15eV ;
[0041] (5)定量与定性同时检测：
[0042] 取13种化学药物的对照品储备液，配制一系列不同质量浓度的混合标准液，于上 述条件和设定的13种降糖或降压类化学药物的质谱参数下分别进样测定，以各物质定量 离子峰面积的平均值（Y)与被测组分的质量浓度（X，mg/mL)进行回归，得到线性方程、相关 系数和线性范围，如表2所示；
[0043] 取待测中药制品或保健品进行样品预处理，得待测样品，进样测定；用线性方程对 样品进行定量，样品中的13种物质的响应值应在仪器检测的线性范围内；实现定量检测。
[0044] 然后将在线采集到的13种化合物EPI谱图与标准EPI谱图进行在线比对，确定13 种化合物是否出现假阳性结果，实现定性检测。
[0045] 所述方法（5)中，样品预处理方法：取中药制品或保健品一次服药量（0.2~ 〇. 5g)(固体的研成粉末状，液体的直接取样），将其加入到50mL容量瓶中，加入40mL乙腈 混匀，室温下超声提取20min，取出后放置到室温，加入乙腈定容至50mL，经0. 22 y m滤膜过 滤后得到待测样品。
[0046] 所述方法（5)中，优选的，13种降糖或降压类化学药物的质谱参数如表1所示。该 条件下，样品母离子获得最大传输效率和子离子在质谱中有较高的响应强度，提高检测方 法的灵敏度。
[0047] 本发明的有益效果是：
[0048] 本发明最突出的创新型在于本方法依托多反应监测（sMRM) -信息依赖性采集 (IDA) -增强子离子扫描（EPI)检测技术，通过一针进样，即可同时得到定性和定量的结 果。在MRM模式下，可以得到13种目标化合物的定量检测结果，灵敏度和准确性较好；同 时，通过IDA-EPI数据的采集与EPI标准谱库的对比，可有效避免基质干扰和假阳性结果的 出现。
[0049] 本发明使用乙腈-水体系作为流动相时，色谱峰形对称，灵敏度高。对不同型号的 色谱柱进行考察，发现使用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱的分离效果好且有良好的色谱 峰形。分别对13种化学药物的去簇电压（DP)和碰撞能量（CE)等进行优化，以使样品母离 子获得最大传输效率和子离子在质谱中有较高的响应强度，提高检测方法的灵敏度。
[0050] 本发明样品通过简单的乙腈提取，直接进样检测，即可快速得到结果，不仅节省了 样品前处理的时间，而且避免了样品在前处理过程中的损失，且样品的回收率较好。
[0051] 本发明利用高效液相色谱-四级杆串联线性离子阱质谱开发了一种同时定性、定 量检测（多反应监测SMRM -信息依赖性采集IDA -增强子离子扫描EPI模式检测）中药 及保健品中非法添加盐酸可乐定、格列齐特等13种降糖降压类化学药物的方法。而且通过 一次进样检测，不仅可以得到定量的结果，还可以通过定性数据库的筛选，有效地避免假阳 性结果的出现。该方法的建立，为中药及保健品中非法添加降糖降压类化学药物检测标准 的制定提供了技术支持。
【附图说明】
[0052] 图1是13种降糖或降压类化学药物质谱检测（MRM模式）离子流图。
[0053] 图2是盐酸可乐定标准EPI图谱。
[0054] 图3是阿替洛尔标准EPI图谱。
[0055] 图4是硝苯地平标准EPI图谱。
[0056] 图5是盐酸哌唑嗪标准EPI图谱。