尿液中甲基马尿酸的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析方法，具体涉及一种尿液中甲基马尿酸的检测方法。
【背景技术】
[0002]二甲苯为无色透明、有芳香烃特殊气味的液体，是苯环上两个氢被甲基取代的产物，存在邻、间、对三种异构体。二甲苯具有挥发性，特臭、易燃，与乙醇、氯仿或乙醚能任意混合，在水中不溶。作为一种很重要的化工原料，工业用二甲苯是指由45%?70%的间二甲苯、15%?25%的对二甲苯和10%?15%的邻二甲苯3种同分异构体所组成的混合物。
[0003]工业上二甲苯主要用于油漆及其稀释剂、粘胶剂和制药等工业，以及各种涂料的添加剂、航空燃料的高效抗爆剂、纤维、塑料、橡胶、染料的合成及邻苯二甲酸的生产，此外间二甲苯还用于异肽酸的生产，对二甲苯用于对苯二酸的合成和聚酯的生产。非工业暴露主要来自于汽车排气，石油产品的使用、储存、运输，废物处理。人们也可能通过吸烟暴露于二甲苯，或消费含二甲苯的食物，或通过皮肤接触含二甲苯的商品，一般人群平均每天吸入的二甲苯为0.3-8.6ug/kg，通过摄入饮用水每天暴露的量为0.06ug/kg，因此二甲苯具有典型的低水平背景。
[0004]研宄表明大量或长期接触二甲苯会对人体产生严重的毒害作用，二甲苯同分体异构体毒代动力学相似，毒性效应也类似，经呼吸道吸入高浓度二甲苯会引起鼻、咽喉刺激，呼吸困难，肺炎、肺水肿。经皮肤直接接触会引起刺激，红斑，干燥，脱脂，灼热，起水疱，皲裂，最后导致皮炎。直接接触眼会导致眼刺激，结膜炎，角膜灼伤。尿中甲基马尿酸是二甲苯进入人体的特征代谢产物，且尿中甲基马尿酸浓度与接触二甲苯浓度高度相关，可作为职业接触二甲苯的特异生物标志物。因尿中甲基马尿酸具有特异性强、灵敏度高的特征，且采样方便，许多国家均颁布了二甲苯的生物接触限值以保护劳动者的健康，定期对劳动者进行生物监测，与环境监测结合以评价二甲苯的暴露程度。目前，我国对二甲苯尿代谢产物的研宄尚处于起步阶段，已制定二甲苯的空气接触限值，尚未制定相应的生物限值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种尿液中甲基马尿酸的检测方法，该检测方法灵敏度高、精密度好、回收率高、稳定性好，各项方法学指标均符合职业卫生标准制定指南第五部分-生物材料中化学物质测定方法的相关要求。
[0006]尿液中甲基马尿酸的检测方法，包括以下步骤:
步骤1，取尿样，加入对氯苯甲酸、对苯二酚、3，4_ 二对羟基苯丙氨酸，振荡混合，离心； 步骤2，在步骤I离心所得上清中加入盐酸溶液、氯化钠和乙酸乙酯，振荡混合，离心； 步骤3，取步骤2离心所得上清，旋转蒸发；
步骤4，将步骤3所得残渣加至蒸馏水中，纳滤浓缩，浓缩液进高效液相分析。
[0007]作为上述发明的进一步改进，步骤I中尿液用量为50?100mL，对氯苯甲酸用量为I?5g，对苯二酚用量为2?6g，3，4- 二对羟基苯丙氨酸用量为I?4g。
[0008]作为上述发明的进一步改进，步骤I中离心条件为5000?7000rpm，离心时间为3 ?5min。
[0009]作为上述发明的进一步改进，步骤2中上清用量为50?100mL，盐酸溶液为5?1mL,氯化钠3?7g，乙酸乙酉旨I?6mL。
[0010]作为上述发明的进一步改进，步骤2中离心条件为3000?5000rpm，离心时间为3 ?5min。
[0011]作为上述发明的进一步改进，步骤3中旋转蒸发温度为50?65°C，真空度为0.1MPa。
[0012]作为上述发明的进一步改进，步骤4中纳滤膜的材质是陶瓷、聚醚砜或聚酰胺，纳滤膜的截留分子量为100?500Da，纳滤的压力范围是1.0?4.0Mpa0
[0013]作为上述发明的进一步改进，步骤4中高效液相的色谱条件为色谱柱C18反相色谱柱，柱温35°C，流动相甲醇:0.1ν/ν9?Κ乙酸=30:70，流速0.8mL/min，测定波长230nm，进样量10 μ L0
[0014]本发明提供的检测方法灵敏度高、精密度好、回收率高、稳定性好，各项方法学指标均符合职业卫生标准制定指南第五部分-生物材料中化学物质测定方法的相关要求，可用于职业接触二甲苯工人以及非职业接触二甲苯人群尿中甲基马尿酸3种同分异构体的测定。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
尿液中甲基马尿酸的检测方法，包括以下步骤:
步骤1，取尿样，加入对氯苯甲酸、对苯二酚、3，4_ 二对羟基苯丙氨酸，振荡混合，离心； 步骤2，在步骤I离心所得上清中加入盐酸溶液、氯化钠和乙酸乙酯，振荡混合，离心； 步骤3，取步骤2离心所得上清，旋转蒸发；
步骤4，将步骤3所得残渣加至蒸馏水中，纳滤浓缩，浓缩液进高效液相分析。
[0016]步骤I中尿液用量为50mL，对氯苯甲酸用量为lg，对苯二酚用量为2g，3，4-二对羟基苯丙氨酸用量为lg。
[0017]步骤I中离心条件为5000rpm，离心时间为5min。
[0018]步骤2中上清用量为50mL，盐酸溶液为5mL，氯化钠3g，乙酸乙酯lmL。
[0019]步骤2中离心条件为3000rpm，离心时间为3min。
[0020]步骤3中旋转蒸发温度为50°C，真空度为0.1MPa0
[0021]步骤4中纳滤膜的材质是陶瓷、聚醚砜或聚酰胺，纳滤膜的截留分子量为lOODa，纳滤的压力范围是4.0Mpa0
[0022]步骤4中高效液相的色谱条件为色谱柱C18反相色谱柱，柱温35°C，流动相甲醇:0.1ν/ν9?Κ乙酸=30:70，流速 0.8mL/min，测定波长 230nm，进样量 1yL0
[0023]本实施例的甲基马尿酸测定方法在0.015?0.2mg/mL的检测范围内线性良好，2，3，4-甲基马尿酸的相关系数分别为0.9997、0.9996、0.9998，检出限达到0.39mg/L、
0.37mg/L、0.41mg/Lo低、中、高浓度的加标回收率范围为93.5?102.3%，精密度范围为
1.9 ?8.Tl。
[0024]实施例2
尿液中甲基马尿酸的检测方法，包括以下步骤:
步骤1，取尿样，加入对氯苯甲酸、对苯二酚、3，4_ 二对羟基苯丙氨酸，振荡混合，离心； 步骤2，在步骤I离心所得上清中加入盐酸溶液、氯化钠和乙酸乙酯，振荡混合，离心； 步骤3，取步