] 术语"结合抗原的"抗原结合部分用于指示存在于实验动物或患者的循环中的结 合其抗原的抗原结合部分。在进一步的实施方式中，结合抗原的抗原结合部分为抗体。在 进一步的实施方式中，结合抗原的抗原结合部分为治疗性抗体。
[0131] 术语"未结合的"抗原结合部分用于指示存在于实验动物或患者的循环中的未结 合其抗原的抗原结合部分。在进一步的实施方式中，抗原结合部分为抗体或其片段。在进 一步的实施方式中，抗原结合部分为治疗性抗体。
[0132] 术语"集合"或"文库"意指至少两个成员。术语"成员"包括但不限于，编码抗体 或其片段的核酸，或抗体或其片段本身。
[0133] 术语"文库"意指一组实体，其包含两个或多个具有如本文所描述的多样性的实 体。例如，"抗体或抗体片段的文库"意指一组多核苷酸，其包含两个或多个编码抗体或抗 体片段、并具有本文所描述的多样性的多核苷酸。例如可使用市售的噬菌体展示文库，例如 MorphoSys HuCALPLATINUM?文库。
[0134] 本文使用的术语"多样性"意指多种多样或明显的异质性。
[0135] 术语"骨架"意指由Kabat等（1991)定义为作为可变结构域的一部分用作该可变 结构域的抗原结合环（antigen binding loop)的支架的抗体可变结构域。骨架区的例子 包括可变重链或可变轻链的FR1、FR2、FR3或FR4。
[0136] 术语"同种型"意指由重链恒定区基因提供的抗体类别（例如IgM、IgE、IgG(如 IgGl或IgG4))。同种型也包括这些类别中的一类的修饰版本，其中作出修饰以改变Fc功 能，例如，以增强或降低效应子功能或与Fc受体的结合。
[0137] "抗独特型抗体"是指特异性地结合另一抗体的抗原结合区并因此特异性地被所 述另一抗体结合的一种抗体。抗独特型抗体可模拟另一抗体通常所识别的表位。独特型是 在免疫球蛋白可变区中由基因决定的结构变化。独特型变异的确切遗传学基础只得到部分 解释。然而，独特型变异涉及，尤其是在抗原结合区的区域中的氨基酸序列和蛋白质结构 (所谓的决定子），也称为独特位（idiotope)。术语"独特型"指定抗体分子的可变区的全 套决定子。
[0138] 术语"氨基酸"意指天然存在的氨基酸以及合成氨基酸，以及以类似于天然存在的 氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码 所编码的氨基酸，以及后来经过修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸以及 〇-磷酸丝氨酸（〇-phosphoserine)。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基 本化学结构的化合物，即一个a碳，该a碳结合至氢、羧基、氨基以及R基，例如高丝氨酸、 正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基硫。这些类似物具有经修饰的R基（例如正亮氨酸）或 经修饰的肽主链，但仍然保持有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物 意指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的 化合物。
[0139] 术语"核酸"在本文中与术语"多核苷酸"可互换使用，并意指脱氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸以及其呈单链或双链形式的聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经 修饰的主链残基或键合的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有类 似于参考核酸的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。这些类似物的实例包括 但不限于硫代磷酸醋类（phosphorothioates)、氨基磷酸醋类（phosphoramidates)、甲基 膦酸酯类、手性-甲基膦酸酯类、2-0-甲基核糖核苷酸类、肽-核酸（PNA)。除非另外指出， 否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体（例如简并密码子替换）和互补序 列，以及明确表明的序列。确切地，具体如下，简并密码子替换可通过产生如下序列来达成， 在该序列中一个或多个选定的（或全部）密码子的第三位置使用混合碱基和/或脱氧肌苷 残基进行替换（Batzer 等（1991) Nucleic Acid Res. 19:5081 ;0htsuka 等（1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608 和 Rossolini 等（1994)Mol. Cell. Probes 8:91-98)。
[0140] 术语"重组宿主细胞"（或只是"宿主细胞"）是指已引入重组表达载体的细胞。应 当理解，这样的术语不仅意指特定对象细胞，且亦指这种细胞的后代。由于某些修饰由于突 变或环境影响可出现在后代中，使这种后代事实上可能与亲代细胞不相同，但仍被包括在 如本文所用的术语"宿主细胞"的范围内。
[0141] 本文所用的术语"载体"是指用于将外源遗传材料导入另一个细胞的分子载体。载 体本身通常是DNA序列，其由插入物（目标序列）和起载体"骨架"作用的较长序列组成。 将遗传信息转入另一个细胞的载体的目的通常是在靶细胞中分离、倍增或表达插入物。
[0142] 如本文中使用的术语"横向流动"是指沿着基底或载体平面（例如横向流动膜） 的液体流动。一般而言，横向流动装置包含条带（或流体连通的多个条带），条带的材料使 其可通过毛细作用（即芯吸或层析作用）输送溶液，其中条带中不同的区域或地带包含测 定试剂，其扩散或不扩散地结合底物，并当溶液输送至或迀移通过这样的区域时，产生可检 测的信号。通常，此类测定包含适于接受液体样品的施加区域、与施加区域横向间隔并与其 流体连通的试剂区域以及与试剂区域横向间隔并与其流体连通的检测区域。试剂区域可包 含化合物（例如抗体），其可在液体中移动，并可与样品中的分析物相互作用（例如形成分 析物-试剂复合物）和/或与结合于检测区域的分子相互作用。检测区域可包含结合分子 (如抗体），其固定在条带上，并能与分析物和/或试剂和/或分析物-试剂复合物相互作 用，以产生可检测的信号。可使用此类测定法通过直接的（夹心测定）或竞争性结合来检 测样品中的分析物。横向流动装置的实例在US 6, 194, 220、US 5, 998, 221和US5, 798, 273 中提供。
[0143] 表1 :序列
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CN104995517A 说明书 19/24 页
[0147]
[0148] 实施例
[0149]牛成特异于抗体/抗原复合物的Fab片段和抗体
[0150] 使用市售的菌体展示文库--MorphoSys HuCALPLATINUM?文库，进行特 异性识别抗体/抗原复合物的抗体的选择。所述抗体文库基于HllCAL?概念（Knappik 等，（2000) J Mol Biol 296:57-86)，并采用CysDisplay?技术以将Fab展示在噬菌体表面 上（W02001/05950，Lohning)。然而，任何其它可用的抗体库也将适用于鉴定复合物特异性 的抗体。
[0151] 为鉴定抗体/抗原复合物特异性抗体，已开发淘选策略（panning strategy)以革巴 向抗体/抗原复合物。由此，使用纯化的重组抗原及其各自的重组治疗性抗体进行淘选。 根据下文所描述的实施例，对于3种不同的抗体/抗原复合物，鉴定仅结合特定复合体的抗 体。所有描述的淘选策略和抗原用于抗体选择过程。每种淘选策略包含至少3轮单独的淘 选，且包含独特的抗原、抗体浓度和洗绦严谨度（washing stringency)。
[0152]实施例1 :特异于阿汰太单抗/TNF-a复合物的Fab片段和抗体的牛成和表征
[0153] 为鉴定特异性地结合阿达木单抗/TNF-a复合物的抗体，使用与磁珠（magnetic beads)结合的重组TNF-a (BioLegend 570108,批号B137143)和阿达木单抗，作为溶液淘 选方法的抗原。
[0154] a)淘选
[0155] 对于溶液淘选，将TNF-a共价结合到Epoxy M-450磁珠（Dynabeads M_450，Dynal)，对菌体展示抗体文库（phage display antibody library)的菌体制备 物进行洗绦，使用Chemiblocker(Chemicon)进行封闭。
[0156] 为提供阿达木单抗/TNF-a复合物，将结合到磁珠的重组TNF-a与阿达木单抗 一起预孵育。对于第一轮淘选，在Chemiblocker (Chemicon)和Tween/PBS的存在下，在纯 化人 IgGlkappa(50 y g/mL)、10 % 人血清、50 y g/ml 利妥昔单抗（IgGlkappa)以及 1 y g/ mL TNF-a的存在下将噬菌体抗体加至阿达木单抗/TNF-a复合物，以吸附所有特异于 IgGlkappa和游离TNF-a、或与人血清中的任何组分交叉反应的噬菌体抗体。当在旋转器 上于2至8°C孵育过夜后，将噬菌体-抗原混合物转移至试管，并使用磁性分离器捕获磁珠。 从磁珠小心地移除上清液，并使用PBST洗涤剩余的磁珠。
[0157] 以类似的方式进行随后的第2和第3轮淘选，并以递增浓度的游离TNF-a (第2 轮淘选中5 y g/ml ;第3轮淘选中25 y g/ml)增加严谨度，弃掉与游离TNF- a交叉反应的 抗体。
[0158] 在每一轮的淘选中，余下的噬菌体被洗脱，且将洗脱的噬菌体立刻用于E.Coli TG1细菌的感染。在使用辅助噬菌体救援（rescue)噬菌体后，对多克隆扩增的噬菌体产 出再次滴定，并在连续的选择步骤中使用。在第3轮的淘选后，将从感染的细菌中分离出 洗脱的抗原特异性噬菌体DNA，且将Fab编码的DNA通过PCR亚克隆到特异的Fab表达载 体中。在TG1-F细菌转化后，使用Fab编码载体，进行包含HuCAL Fab片段的周质提取物 (periplasmic extract)的单克隆表达和制备。使用含Fab周质提取物进行初步筛选和表 征。
[0159] 使用纯化的Fab进行进一步的表征。在摇瓶培养中使用补充有ImM氯霉素和0. 1% 葡萄糖的500ml的2 X YT培养基进行TG-1细胞中Fab片段的表达。通过添加0. 75mM IPTG， 在30°C下20小时诱导表达。使用含有溶菌酶、Bugbuster、核酸酶（Benzonase)和由Ni-NTA 层析（Bio-Rad，德国）分离的Fab片段的裂解缓冲液来破坏细胞。使用UV分光光度法测定 蛋白质浓度。在变性、还原的状态中使用SDS-PAGE，以及在自然状态（native state)中使 用HP-SEC，分析Fab片段的纯度。
[0160] 为了表达全长IgG，从Fab表达载体亚克隆重链（VH)和轻链（VL)的可变域片段到 人 IgG2、人 IgG4、人 IgG4_Pro 和人 IgGlf LALA 的合适的pMORPH?_hIg载体中。
[0161] b)筛查
[0162] 使用ELISA进行初次筛查。在上文所描述的淘选步骤的产出中随机挑选368个克 隆，并使其在384孔ELISA板中生长。在诱导抗体表达（0. 75mM IPTG，30°C下20小时）和 使用溶菌酶进行细胞裂解后，将含有抗体的细胞裂解物在ELISA中进行测试。
[0163] 因此，将下文中的抗原在ELISA板上进行涂覆：阿达木单抗/TNF-a复合物、来自 骨髓瘤细胞系的纯化人IgGl/kappa、利妥昔单抗及游离的重组TNF-a。
[0164] 总共识别出12个对复合物显示阳性（信号为背景的至少5倍以上）、但不结合其 它抗原的克隆。因此，将这12个克隆进行测序，以鉴定独特抗体。可鉴定出七个独特的序 列。对这7个克隆进行表达和纯化，并随后表征。
[0165] c)表征
[0166] 首先，在ELISA中，将这7个抗体针对一系列不相关和相关的抗原和阿达木单抗/ TNF-a复合物进行特异性结合测试，其中阿达木单抗涂覆在板上并用TNF-a来形成复合 物，或反过来。由此，在微量滴定板上涂覆5 y g/mL的各抗原，过夜。在使用5% BSA洗涤和 封闭后，加入Fab-FH(来自2yg/mL溶液的20yL)形式的抗阿达木单抗/TNF-a抗体。使 用HRP标记的抗His抗体和QuantaBlu焚光过氧化酶底物进行检测。已证明AdaTNF#l和 AdaTNF#5高度特异于复合物（图1)。
[0167] 在下一步骤中，通过在不同的固定化抗原上滴定抗体，更具体地测试AdaTNF#5。在 测试的浓度范围内（0. 03至2000ng/mL)，所述的抗体仅与阿达木单抗/TNF- a复合物结合， 而不与英夫利昔单抗/TNF-a复合物、未结合的阿达木单抗、游离的TNF-a或其它抗原结 合（图2)。
[0168] 将AdaTNF#5转化为全长人IgGl形式，在人细胞系中表达，并通过蛋白质A层析纯 化，以进行进一步的分析。首先，对所述抗体在（二价的）IgGl形式中是否仍显示相同的 特异性进行测试。以5yg/mL在微量滴定板上涂覆抗原过夜。在使用5% BSA洗涤和封闭 后，加入HRP结合的AdaTNF#5-hIgGl (HiSpec缓冲液中，来自2 y g/mL溶液的20 y L)。使用 QuantaB丨u?荧光过氧化酶底物进行检测。HPR结合的纯化的AdaTNF#5-hIgGl特异性地 结合阿达木单抗