一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，以及基于此的快速去除干扰物质如 表面活性剂干扰的蛋白含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 由于蛋白质药物具有作用靶点专一、疗效明显等优点，因而蛋白质药物的研究越 来越被广泛关注，近年来已有多种重组蛋白药物被国家食品药品监督管理批准应用于临床 治疗各种疾病。但蛋白质本身具有容易降解和聚集而失活的特性，因而如何长期保持其活 性一直是生物制药领域的难点。为了使蛋白质药物不失活，通常需要在蛋白质药物配方中 加入某些非蛋白的辅料（如蔗糖、甘露醇、乳糖等）或非离子型的表面活性剂，如聚山梨醇 酯（Tween)、山梨醇酯（Span)等。
[0003] 蛋白质药物生产过程中需要对其质量进行严格监控，其中对其有效活性成分即蛋 白含量进行检定是最重要检测指标之一。蛋白含量的测定方法有多种，包括凯氏定氮法、 双缩脲法、紫外分光光度法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝G250法（Bradford法）等。凯 氏定氮法是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算，容易被氮源干扰，而且灵敏度较低。双 缩脲法、紫外分光光度法测定的灵敏度较低，适用于高浓度蛋白的测定。Lowry法、BCA法、 Bradford法测定的灵敏度高，可以应用于低浓度蛋白含量的测定（微克级的蛋白含量）。因 而这3种方法为常用的微量蛋白测定方法。然而蛋白质药物中添加的各种辅料和表面活性 剂会干扰这些蛋白含量测定方法。例如：蔗糖会干扰Lowry法和BCA法测定结果，表面活性 剂会干扰Lowry法和Bradford法的测定。
[0004] 为了能去除干扰精确测定蛋白质药物的中的蛋白含量，通常采用2种方法，一是 稀释法，即将测定样品进行稀释，以降低干扰物质的浓度，使其不再干扰蛋白测定方法。但 是对测定样品进行稀释，不仅降低了干扰物质的浓度，同时也降低了蛋白浓度，常常会使蛋 白浓度低于各蛋白测定方法的检测下限，无法被检测出。其二是蛋白沉淀法。即采用某种 方法将蛋白沉淀，使其与干扰因素分离，从而不影响蛋白检测。蛋白沉淀法既可以去除干扰 因素又可以浓缩蛋白。常用的微量蛋白沉淀法为丙酮沉淀法和三氯乙酸沉淀法（TCA法） 等。但丙酮沉淀蛋白的效率较低，通常需要较长时间（6小时以上），为了增加沉淀的效果， 缩短沉淀时间，常与三氯乙酸联合沉淀蛋白。然而三氯乙酸又能与考马斯亮蓝G250发生显 色反应，影响检测结果。
【发明内容】
[0005] 本发明中，研究人员发现蔗糖能增加丙酮的沉淀蛋白的效率，缩短沉淀时间，并且 蔗糖不与考马斯亮蓝G250发生显色反应，不影响检测结果，因而特别适合对蛋白质药物进 行蛋白定量。为了能够快速有效的分离表面活性剂和蛋白，又不干扰后续的蛋白定量检测， 本发明涉及一种微量蛋白测定的方法，该方法特征是加入丙酮和蔗糖将溶液中蛋白沉淀， 用离心方法分离蛋白和表面活性剂，然后用Bradford法测定蛋白含量。此方法特别适用于 对含有表面活性剂的蛋白质药物进行蛋白定量。
[0006] 具体地，本发明涉及以下各项：
[0007] 1. -种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，所述方法包括：
[0008] 1)将蔗糖加入要沉淀的蛋白样品的溶液中；
[0009] 2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；
[0010] 3)将沉淀的蛋白分离。
[0011] 2.根据1所述的方法，所述有机溶剂包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或其组合。
[0012] 3. -种快速去除蛋白溶液中干扰物质的蛋白含量测定方法，所述方法包括：
[0013] 1)将蔗糖加入待测蛋白样品溶液中；
[0014] 2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；
[0015] 3)将沉淀的蛋白分离；
[0016] 4)将分离的蛋白沉淀溶解，并进行蛋白浓度测定。
[0017] 4.根据3所述的方法，所述有机溶剂包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或其组合。
[0018] 5.根据3所述的方法，所述干扰物质是表面活性剂。
[0019] 6?根据5任一项所述的方法，所述表面活性剂包括但不限于Tween20、Tween40、 Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60、Span80、SDS、TritonX100、苯扎溴铵或 其组合。
[0020] 7.根据3所述的方法，所述蛋白浓度测定的方法包括但不限于凯氏定氮法、双缩 脲法、紫外分光光度法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝G250法。
[0021] 8.根据1或3所述的方法，所述方法均在预冷条件下或在冰浴中进行。
[0022] 本发明的涉及一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，其包括以下步骤：样品处理，沉淀 蛋白。
[0023] (1)样品处理：
[0024] 对于固体型样品，如果样品中含蔗糖且浓度不小于50mg/ml，用合适的溶剂溶解。 如果不含鹿糖或浓度达不到50mg/ml，可以用含鹿糖50mg/ml溶液溶解。
[0025] 对于液体型样品，不含鹿糖或含鹿糖量达不到50mg/ml，直接加入适量的鹿糖制成 含鹿糖不低于50mg/ml蛋白溶液。
[0026] 本领域的普通技术人员知晓蔗糖浓度并不特指50mg/ml，可以根据实际情况选择 其它的蔗糖浓度，以有效地沉淀蛋白。
[0027] ⑵沉淀蛋白
[0028] a)预冷样品和有机溶剂如丙酮：取适量样品EP管中，在冰浴中放置lh。
[0029] b)沉淀蛋白：加入预冷的有机溶剂如丙酮（样品与有机溶剂如丙酮比例为3:7)， 摇匀，在冰浴中放置lh以上。
[0030] c)分离蛋白和其它成分如表面活性剂：4°C，12000g，离心15min。离心结束后，立 即轻轻的倒去上清。
[0031] d)洗涤蛋白沉淀：加入1ml预冷的有机溶剂如丙酮摇勾，冰上静置15min，离心 12000g，10min，立即轻轻的倒去上清，将沉淀物放置冰浴中。重复操作1次。
[0032] e)干燥蛋白沉淀去除残留的有机溶剂如丙酮。
[0033] 本领域的普通技术人员可以预见蔗糖可以促进其它多种有机溶剂如甲醇、乙醇等 对蛋白的沉淀。本领域的普通技术人员也可以预见丙酮-蔗糖沉淀也可以去除多种表面活 性剂的干扰，所述表面活性剂包括且不限于聚山梨醇酯（如Tween20、Tween40、Tween60 等）、山梨醇酯（如Span20、Span40、Span60、Span80 等）、SDS、TritonX100、苯扎溴铵 等。
[0034] 进一步地，在用蔗糖促进蛋白沉淀的基础上，本发明还涉及一种去除表面活性剂 干扰的快速微量蛋白测定方法，所述方法进一步包括以下步骤：
[0035] (3)测定蛋白含量
[0036] a)制备供试品：加入适量的水或PBS溶液于含蛋白沉淀的EP管中，震荡混匀。
[0037] b)制备标准蛋白溶液，制成浓度为0、2. 5、5、10、15、20yg/ml蛋白溶液。
[0038] c)测定吸光值
[0039] 各标准品和样品加入考马斯亮蓝G250染液，混匀，吸取适量，在595nm处测定吸光 值。
[0040] d)计算蛋白含量
[0041] 根据各标准品的吸光值和蛋白浓度制定标准曲线，根据回归方程计算蛋白含量。
[0042] 本发明的方法具有以下有益效果：
[0043] (1)本发明能够去除表面活性剂的干扰，快速测定溶液中微量蛋白的含量。
[0044] (2)本发明丙酮-蔗糖蛋白沉淀的回收率较丙酮沉淀法回收率高，沉淀时间短，
[0045] (3)本发明蛋白含量检测基于Bradford法，检测灵敏度高，能够应用于微量的蛋 白制剂。
【附图说明】
[0046] 图1，丙酮沉淀前后BSA溶液的吸收光谱变化
[0047] 图2,蛋白标准曲线
[0048] 图3,不同浓度蔗糖对丙酮沉淀蛋白回收率的影响。
[0049] 图4,不同浓度蔗糖对考马斯亮蓝G250吸光度的影响。
[0050] 图5,SDS-PAGE电泳检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白
[0051] 图6,HPLC-SEC检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白
[0052] 图7,蔗糖促进乙醇对蛋白的沉淀作用
【具体实施方式】
[0053] 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式 限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明所 有的化学试剂均为分析纯，无特殊说明所有试剂均为商用常规试剂，可以购买或按说明书 配制。例如，考马斯亮蓝染液可以按以下配方配制：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml95% 乙醇，加入l〇〇ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml, 0. 45ym滤膜过滤；也可以从BioRad 或Thermo等公司等购买。
[0054] 实施例1丙酮沉淀去除聚山梨醇酯80(Tween80):
[0055] 1)样品制备：取合适的Tween80溶液加入牛血清白蛋白（BSA)溶液中，使Tween 80溶液的终浓度为0、0. 5、2mg/ml，BSA终浓度为20yg/ml。各取0. 6ml于2mlEP管中，预 冷。
[0056] 2)沉淀蛋白：向各样品溶液中加入1. 4ml预冷的丙酮，摇勾，冰浴放置lh，12000g 离心15min去除上清；再将各管中加入0. 6ml预冷丙酮，充分混勾，冰浴放置lOmin，12000g 离心lOmin去除上清，再重复1次。自然吹干，去除丙酮残留液。最后向蛋白沉淀中加入 0? 6ml水。
[0057] 3)光谱扫描：取含0、0? 5、2mg/mlTween80的BSA溶液0?6ml，以及沉淀后的 各样品中，加入〇. 15ml考马斯亮蓝G250染液（购于BioRad公司），混匀放置lOmin，在 350-700nm处进行连续光谱扫描。
[0058] 4)结果见图1，丙酮沉淀前，550nm-650nm处的吸光值随着Tween80浓度的增加