一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色 谱方法。
【背景技术】
[0002] 托伐普坦（Tolvaptan商品名：Samsca)，化学名为N-[4_[ (5RS) -7-氯-5-轻 基-2, 3, 4, 5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺（分 子量：C26H25C1N203)，化学结构式见式I，是由日本大冢制药公司（OtsukaPharm)开发的一 种口服选择性非肽类新型精氨酸加压素V2受体拮抗剂。美国FDA于2009年5月批准其用 于治疗由充血性心力衰竭（CHF)、肝硬化以及抗利尿激素分泌不足综合征所导致的高容性 或等容性低钠血症（血钠< 125mg/L，或者症状轻微）。口服托伐普坦片能明显减轻患者体 重和水肿，且不破坏血电解质平衡，并能有效升高CHF患者并发的低钠血症。临床研究表 明，托伐普坦与其它抗心衰药物相比耐受性好，治疗中不必限制水的摄入，不良反应轻，应 用前景广阔。
[0003] 托伐普坦可以通过下述路线合成：
[0004] ?V
'
[0005] 其中，式1￥所示的^[4-[7-氯-5-氧代-2,3,4,5-四氢-111-苯并[13]氮杂 卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-2-甲基苯甲酰胺（分子量：C26H23C1N203)是托伐普坦合成路 线的重要中间体，同时也是托伐普坦的主要降解产物。
[0006] 式（a)所示的邻甲基苯甲酰氯，是合成托伐普坦的重要起始物料，式（b)所示的对 甲基苯甲酰氯和式（c)所示的间甲基苯甲酰氯均为其位置异构体杂质。由于邻甲基苯甲酰 氯（a)在紫外光波长下无吸收，且较易水解，无法通过高效液相色谱法进行检测。即使采用 现有气相色谱法进行检测，也无法对其位置异构体杂质对甲基苯甲酰氯（b)和间甲基苯甲 酰氯（c)进行质量控制。
[0007] 因此，当对甲基苯甲酰氯（b)参与托伐普坦的合成反应，会生成式II所示的 N-[4-[7-氯-5-羟基-2,3,4,5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯 基]-4-甲基苯甲酰胺和式V所示的N-[4-[7-氯-5-氧代-2, 3, 4, 5-四氢-1H-苯并[b] 氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-4-甲基苯甲酰胺；而间甲基苯甲酰氯（c)参与托伐 普坦的合成反应，则生成式III所示的N-[4-[7-氯-5-羟基-2, 3, 4, 5-四氢-1H-苯并[b] 氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-3-甲基苯甲酰胺和式VI所示的N-[4-[7-氯-5-氧 代-2, 3, 4, 5-四氢-1H-苯并[b]氮杂卓-1-甲酰基]-3-甲基苯基]-3-甲基苯甲酰胺。
[0008]
[0009] 可见，由于邻甲基苯甲酰氯中含有难以控制的位置异构体杂质，会导致式IV化合 物含有杂质V、VI，这些杂质会在制备托伐普坦的反应中分别生成式II和式III化合物。因 此，以上五个杂质的存在对托伐普坦的临床用药安全构成了潜在的威胁。然而，仅有托伐普 坦喷雾干燥粉质量标准的复核说明（标准号：JX20110046)报道了杂质IV的检测。而托伐 普坦I的位置异构体杂质II、111以及托伐普坦中间体IV的位置异构体杂质V和VI的检测方 法的并未见相关报道。
[0010]因此，实现托伐普坦的位置异构体杂质及托伐普坦中间体的位置异构体杂质的分 离测定对于托伐普坦质量控制方面具有现实意义。
【发明内容】
[0011] 为解决上述问题，本发明提供了一种分离测定托伐普坦中多个杂质的液相色谱方 法，实现了托伐普坦及其五个杂质的分离测定。包括以下步骤：
[0012] 'V.
X}
[0013] (1)获得各杂质对照品的保留时间以及峰面积与浓度的对应关系：
[0014] a、分别取杂质II、111、IV、V、VI的对照品，加入溶剂溶解，作为对照品溶液，分别注 入高效液相色谱仪进行检测，检测条件为：
[0015] 检测波长：230nm~280nm;
[0016]色谱柱：SymmetryshieldRP18;
[0017]流动相：乙腈-含有0.2%磷酸的水溶液，其中，乙腈的体积分数为43-47%;
[0018] b、记录各杂质相应的保留时间、浓度和峰面积；
[0019] (2)检测待测样品：
[0020] c、取待测托伐普坦样品，加入溶剂溶解，作为供试品溶液，注入高效液相色谱仪进 行检测，以步骤a相同的检测条件检测；
[0021] d、根据步骤b的结果确定步骤c所得谱图中的各峰归属，记录供试品溶液中杂质 II、III、IV、V和VI的峰面积，按外标法计算供试品中杂质II、III、IV、V和VI的含量。
[0022] 进一步优选地，所述检测波长为254nm。
[0023] 进一步优选地，所述色谱柱的长度为150mm，内径为4. 6mm，填料的粒径为5ym。
[0024] 进一步优选地，所述流动相中乙腈的体积分数为45 %。
[0025] 进一步优选地，所述色谱条件的柱温为20-30°C。
[0026] 进一步优选地，所述柱温为25°C。
[0027] 进一步优选地，所述流动相的流速为1.OmL/min。
[0028] 进一步优选地，所述溶剂为甲醇。
[0029] 进一步优选地：所述对照品溶液的浓度为1. 0-6. 0yg/mL
[0030] 进一步优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为10iiL。
[0031] 本发明通过筛选出的高效液相色谱检测条件，尤其是对色谱柱的筛选和流动相比 例的筛选，能够测定出托伐普坦产品中的杂质II、III、IV、V和VI的含量，解决了通常情况下 托伐普坦的位置异构体杂质之间及托伐普坦中间体的位置异构体杂质之间难以分离的问 题。该方法专属性强，简便、快速、精确，测定结果准确可靠，从而可以有效监控托伐普坦的 质量，提高了药物的安全性。
[0032] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限 制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述 基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明检测条件的对照品溶液的HPLC图；
[0034] 图2为实施例1中对比检测条件1的对照品溶液的HPLC图；
[0035] 图3为实施例1中对比检测条件2的对照品溶液的HPLC图；
[0036] 图4为实施例1中对比检测条件3对照品溶液的HPLC图；
[0037] 图5为试验例第1项的托伐普坦I的紫外光谱图；
[0038]图6为试验例第1项的杂质II的紫外光谱图；
[0039]图7为试验例第1项的杂质III的紫外光谱图；
[0040]图8为试验例第1项的杂质IV的紫外光谱图；
[0041] 图9为试验例第1项的杂质V的紫外光谱图；
[0042]图10为试验例第1项的杂质VI的紫外光谱图；
[0043] 图11为试验例第2项的供试品溶液的HPLC图；
[0044] 图12为试验例第2项的杂质II定位溶液的HPLC图；
[0045] 图13为试验例第2项的杂质III定位溶液的HPLC图；
[0046] 图14为试验例第2项的杂质IV定位溶液的HPLC图；
[0047] 图15为试验例第2项的杂质V定位溶液的HPLC图；
[0048] 图16为试验例第2项的杂质VI定位溶液的HPLC图；
[0049] 图17为试验例第2项的系统适用性溶液的HPLC图；
[0050] 图18为试验例第2项的溶剂的HPLC图；
[0051] 图19-23为各杂质的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度；
[0052] 图19为试验例第3项的杂质II的标准曲线；
[0053] 图20为试验例第3项的杂质III的标准曲线；
[0054] 图21为试验例第3项的杂质IV的标准曲线；
[0055] 图22为试验例第3项的杂质V的标准曲线；
[0056] 图23为试验例第3项的杂质VI的标准曲线。
【具体实施方式】
[0057] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，均可通过购买市售产品 获得。具体如下：
[0058] 托伐普坦I(粗品）的批号为20131101;杂质II对照品的批号为20131218,含 量：99. 14% ;杂质III对照品的批号为20131218A，含量：99. 11% ;杂质IV对照品的批号为 20131101，含量：99. 7% ;杂质V对照品的批号为20131215,含量：99. 0% ;杂质VI对照品的 批号为20131216,含量：99. 24% ;均来源于成都百裕科技制药有限公司。实施例和试验例 中的托伐普坦I和杂质II、III、IV、V和VI的对照品均为上述产品。
[0059]UV-2600型紫外-可见分光光度计可购自岛津公司；AUW220D型精密电子天 平可购自岛津公司；LC-20AT型高效液相色谱栗可购自岛津公司；STO-20A紫外检测器 可购自岛津公司；SIL-20A自动进样器可购自岛津公司；LcSolution工作站可购自岛 津公司；InertSustain?C18(150mmX4.6mm，5ym