流体荧光定量检测装置及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及流体标记物检测技术领域，特别是涉及流体荧光定量检测装置，及应 用该装置定量测定流体中目标检测物含量的方法。
【背景技术】
[0002] 标记物检测技术的原理是：标记物通过免疫反应法、化学反应法、生化反应法、 链霉亲和素和生物素等包被技术，制作成探针；探针通过相应的反应与目标物质结合；检 测仪器通过对标记物的检测，测定出目标物质的浓度。目前，标记物检测技术已经广泛用 于医疗检测、微生物检测、微量元素测定等领域，例如电化学荧光标记分析（ECLI)、酶联免 疫吸附试验（ELISA)、放射免疫分析（RIA)、荧光免疫分析（FIA)、时间分辨荧光免疫分析 (TRFIA)等荧光免疫分析技术。
[0003] 标记突光的免疫分析方法，近年发展迅速，比较具有代表性的是罗氏Elecsys2010 电化学荧光标记分析方法（ECLI)。该方法采用链霉亲和素（streptoavidin，SA)和生物素 (biotin，B)包被技术，将抗原(或抗体）包被在直径2. 8 ii m的聚苯乙烯磁性微球上，荧光标 记物采用具有电激发化学光特性的三联吡啶钌。当磁性微球、荧光标记物与样品中的检测 目标物质反应后，目标物质会携带荧光标记物聚集在磁性微球表面。Elecsys利用磁性微 球的磁性特征，将磁性微球固定在电磁铁周围，然后进行冲洗，清除游离的荧光标记物。清 洗后的微球放置在检测区域，施加电场，使电化学发光的突光标记物质被激发出波长620nm 的荧光，通过检测高特异性的荧光强度，参考标准曲线，实现目标物质的定量测定。
[0004] 酶标法（ELISA)，将抗原或抗体与酶用胶联剂结合成为酶标抗原或抗体，将样品池 内壁包被同样的抗原或抗体。加入样品和酶标抗原或抗体，样品中的目标检测物抗体或抗 原使酶标抗原或抗体可与内壁上的抗原或抗体发生特异反应，并牢固地结合，形成仍保持 活性的免疫复合物。然后，加入相应底物将免疫复合物显色，通过参考标准曲线或对比颜色 标准板，根据颜色深浅，定量检测目标检测物含量。为检测颜色深浅，需对样品池中游离在 溶液中的酶标、杂质和底物进行清洗和参考标准样品。
[0005] 时间分辨荧光免疫法（TRFIA)，在样品反应、清洗等与荧光免疫法（FIA)基本类 似，只是检测的是更高特性的时间分辨荧光，而非普通FIA检测光激发的瞬时荧光。TRFIA 要求在关掉激发光源后100Ps-lms的时间段内检测荧光，虽然荧光具有高特异性，但由于 荧光本身具有衰减周期，导致激发光源强度、以及检测计时误差会引起检测误差，因此对检 测仪器的一致性要求更高，一般需要仪器在检测样品同时，检测标准样品池，以保证标准曲 线的有效性。
[0006] LumineX200流式荧光检测仪是液相荧光检测仪的代表产品，其检测方法是采用 直径5. 6 y m的聚乙烯微球作为标识微球，标识微球能在635nm光照射时激发两个波长突 光并且强度对比值不同，根据强度比值进行100种编码，分别代表100种标识微球。荧光 标记物是在532nm光照射时能激发575nm波长荧光的物质。当溶液中存在目标检测物时， 突光标记物将附着在相应的标识微球周围。检测时，仪器通过检测635nm识别标识微球编 码，然后根据575nm不同编码微球上的标记荧光强度，参考标准曲线，得到标识微球所结 合的目标检测物含量。LumineX200通过流式检测溶液在细小石英管内对依次通过的微球 进行逐粒检测，因此它是一种液相荧光标记逐粒检测方法。逐粒检测技术的关键是要求每 个微球保持距离，不能相互干扰，否则会造成检测结果假阳性。为了让5. 6ym的微球在 500iimX500iim内径的石英管内依次通过，LumineX200流式荧光检测仪采用了两个关键 技术避免微球层叠：一个是通过使用流式技术将标识微球在石英管内依次排列；另一个是 通过检测微球散射光，识别确认微球是否层叠。流式技术就是利用流动的鞘液的流体力学 原理，使微球在液柱中心排列通过。但流式技术不能保证微球一定会依次排列通过检测窗 口，因此，作为辨别，LumineX200引入了微球散射光检测，当发现散射光异常变化时，系统自 动舍弃该微球的标记荧光检测结果，不纳入检测统计结果。由于lumineX200使用鞘液，导 致了溶液成分改变，因此必须将得到的标记荧光强度，比对参考标准曲线，才能得到检测结 果。
[0007] 综上，目前常规的荧光标记检测技术，都存在以下无法克服的问题：
[0008] 1.为准确获得结合了目标检测物的标记荧光强度，需要清洗和分离，避免样品溶 液中的杂质和溶液中游离的标记物所产生的特异性荧光叠加在荧光背景上，影响检测结 果。
[0009] 2.检测的目标物荧光强度，与目标物含量，需要参考标准曲线才能关联。
[0010] 3.由于检测结果要依赖于参考标准曲线，因此检测实验需要完全模拟标准品的参 考曲线测定场景，如：样品及试剂投放量，清洗、分离步骤，检测仪器量程定标，荧光物质发 光能力定标，环境温度等等，都需要与标准品的测定场景一致。苛刻的试验条件要求，反而 可能导致极低的可重复性。
【发明内容】
[0011] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种流体荧光定量检测装置，它能准确检测 流动液体中的荧光标记物的荧光强度，且具有使用方便、抗干扰能力强、检测效率和灵敏度 _的优点。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明的流体荧光定量检测装置，包括液体流动系统、光路 系统和数据处理系统，其中：
[0013] 液体流动系统包括吸液装置、石英管、微球约束腔和连接管；所述吸液装置用于抽 吸溶液；所述石英管上端连接吸液装置，下端连接微球约束腔，中部开有检测窗口；所述微 球约束腔用于使微球并列进入石英管，该微球约束腔包括有入口腔、限流口和出口腔，入口 腔与连接管上端连接，出口腔与石英管下端连接，限流口为狭缝通孔，狭缝宽度小于微球在 溶液中的最小自由距离；所述连接管下端浸入溶液中，用于作为液体流通的管路；
[0014] 光路系统包括激发光产生装置、检测窗口、带通滤光片及光电转换器；所述激发光 产生装置用于激发荧光标记物产生荧光；所述检测窗口为透光狭缝，狭缝开口与石英管垂 直，并与约束腔限流口开口方向平行；所述带通滤光片用于选择性透过所需波段的光；所 述光电转换器用于将透过带通滤光片的光转换成电信号；
[0015] 数据处理系统包括数据处理器和用户操作界面；所述数据处理器用于控制吸液装 置和激发光产生装置，采集并处理光电转换器的光电数据；所述用户操作界面用于用户操 作信息交互及输出检测结果。
[0016] 本发明要解决的技术问题之二是提供应用上述流体荧光定量检测装置定量检测 流体中目标物浓度的方法，该方法包括以下步骤：
[0017] 1)将标定了可结合目标检测物总量和结合系数的荧光标记物与聚集在标识微球 表面的目标检测物进行结合反应；
[0018] 2)抽取步骤1)得到的混合溶液，流经微球约束腔，使标识微球在石英管内并列且 匀速地通过石英管；
[0019] 3 )连续采集流动溶液的标记荧光信号；
[0020] 4)分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号；
[0021] 5)在连续的检测时间段内，计算标识微球的标记荧光强度和，以及溶液的全部标 记荧光强度和，根据荧光标记物所标定的可结合目标检测物总量和结合系数，利用多元线 性回归公式计算出目标检测物的含量。
[0022] 所述目标检测物包括甲状腺、性激素、骨代谢、心肌梗塞、肿瘤标志物、传染病抗原 抗体和核酸分子等。
[0023] 所述标识微球为单分散微球，可以使用聚苯乙烯微球、硅胶微球以及聚吲哚类杂 环化合物、聚苯胺等导电高分子微球。标识微球的体积越大，聚集目标检测物的能力越强， 其激发出的标记荧光强度与游离溶液中的标记荧光强度的差异也会越大，因此，为了提高 检测灵敏度，宜选用粒径比较大的乳胶微粒(粒径为5-500微米)。
[0024] 荧光标记物激发出荧光的能力与其包含的荧光物质的多少有关，因此，为了提高 检测的灵敏度，宜选用粒径在l〇nm到300nm之间的聚苯乙烯胶或硅烷等突光乳胶微粒。
[0025] 所述步骤4)，可以通过参考荧光信号的波峰和波谷，或参考微球的散射光信号，或 参考磁性微球的磁性特征，来分辨标识微球表面所聚集的标记物荧光信号。
[0026] 本发明通过使用独创的微球约束腔，并采用单分散微球作为载体，避免了因微球 之间互相遮挡而影响荧