基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法。
【背景技术】
[0002]微小RNA(microRNAs，miRNA)是一类长约为17_25nt，高度保守的单链非编码RNA。miRNA通过与mRNA的3’非翻译区(3’ UTR)或编码区(OTS)的结合降解或抑制mRNA，主要在转录后水平调控基因表达。自从1993年第一个microRNA被揭示以来，已经有超过30000种miRNA被发现，诸多研究已经表明，miRNA参与了不同的生理和病理过程，例如的细胞的分化、增殖和凋亡，肿瘤发生等。高达30%的人类基因被miRNA调节，miRNA含量的异常会引起心血管疾病、癌症等疾病。长期以来研究者都是从调控因子和生物标记物两方面对miRNA进行研究，迄今已经有上万篇的论文报道了 miRNA在分子和临床研究中的作用。尽管miRNA作为潜在分子标记物的研究仍处于探索期，但已经有研究对该方面进行了报道，并证明miRNA含量的异常与癌症、心血管疾病、神经性和代谢性疾病、免疫反应等相关，同时也达成了共识:miRNA作为潜在的生物标记物对于临床诊断和预后具有重要意义。
[0003]目前miRNA检测的技术基本分为两类:一类是以扩增为基础的(amplificat1n-based)，即逆转录后进行PCR扩增来检测，主要有qPCR和酶联焚光miRNA检测法；另一类是以杂交为基础的(hybridizat1n-based)，即通过互补序列的探针与待测的miRNA杂交来检测，包括Northern blotting，ISH和Microarray。现有的这两类技术包含的扩增或标记过程中操作较复杂、耗时较长、对反应体系要求较高.
[0004]2014年，英国曼彻斯特大学的Andre Geim教授与Kostya Novaselov博士采用一种简单的微机械剥离法制备了一种单原子厚度的碳膜，即石墨烯薄膜，并因此获得2010年的诺贝尔物理奖，受到了全世界研究人员的关注.
[0005]石墨烯(Graphene)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料，是构建其它维度碳质新材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。作为一种新型的二维碳纳米材料，石墨烯以其独特而优异的电学、热学、力学等方面的性能而成为目前研究的热点。由于石墨烯独特的二维结构，石墨烯具有表面活性高、比表面积大、电子迀移率高、与生物分子相容性好等特点。
[0006]因此，如果能够将石墨烯的上述特点应用于检测MicroRNA中，将提高检测的响应速度、选择准确度和灵敏度。
【发明内容】
[0007]为了克服以上问题，本发明旨在提供一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法，能够快速灵敏的检测MicroRNA。
[0008]本发明提供了一种基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法，其包括:
[0009]步骤01:制备以石墨烯为沟道的石墨烯场效应晶体管，作为石墨烯传感器；
[0010]步骤02:根据待测的MicroRNA序列，对所述石墨稀进行表面改性，将能与所述待测的MicroRNA相结合的DNA探针结合到所述石墨稀表面的官能团上；
[0011]步骤03:将所述石墨稀表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来；
[0012]步骤04:利用改性过的所述石墨烯场传感器对所述待测的MicroRNA进行检测，通过所述石墨烯上的所述DNA探针与所述待测的MicroRNA结合前后的电流信号的差异来检测出所述待测的MicroRNA。
[0013]优选地，所述步骤02包括:
[0014]步骤021:将所述石墨烯场传感器浸入N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液，于室温下反应，通过堆叠效应，N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸自组装到所述石墨烯表面的官能团上；
[0015]步骤022:采用甲醇和去离子水冲洗所述石墨烯传感器；
[0016]步骤023:再将所述石墨烯传感器浸入溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2-吗啉乙磺酸溶液中，于室温下反应，所述DNA探针末端的氨基与所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸发生化学反应，形成酰胺键，从而把所述DNA探针结合到所述石墨烯表面；
[0017]步骤024:用去离子水冲洗所述石墨烯传感器。
[0018]优选地，所述步骤021中，所述N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液的浓度为4.5?5.5mM，所述于室温下反应所采用的反应时间为1.5?2.5小时；
[0019]所述步骤023中，所述溶解有末端修饰氨基的所述DNA探针的2_吗啉乙磺酸溶液的浓度为90?ΙΙΟηΜ，所述于室温下反应所采用的反应时间为11?13小时。
[0020]优选地，所述步骤03中，采用乙醇胺将所述石墨烯表面未与所述DNA探针结合的剩余的官能团封阻起来。
[0021]优选地，所述乙醇胺的浓度为0.05?0.15M。
[0022]优选地，所述步骤04包括:
[0023]步骤041:测试得到未与所述待测的MicroRNA相结合的所述改性过的所述石墨稀传感器的第一电流信号；
[0024]步骤042:将所述改性过的所述石墨稀传感器浸入待测的MicroRNA样本中，于室温下反应；
[0025]步骤043:用去离子水冲洗所述改性过的所述石墨烯传感器，并自然干燥；
[0026]步骤044:测试得到完成所述步骤042之后的所述改性过的所述石墨烯传感器的第二电流信号；
[0027]步骤045:通过比较得到所述第一电流信号和所述第二电流信号存在的差异，从而探测出所述待测的MicroRNA。
[0028]优选地，所述步骤01包括:
[0029]步骤011:制备出石墨烯薄膜；
[0030]步骤012:将所述石墨烯薄膜转移至硅衬底上；
[0031]步骤013:在所述石墨烯上形成源极、漏极、栅极以及所述源极和所述漏极之间的导电沟道，所述导电沟道为部分所述石墨烯薄膜。
[0032]优选地，所述步骤011包括:以铜箔为衬底，采用甲烷为碳源前驱体，在常压下采用化学气相沉积法制备出所述石墨烯薄膜。
[0033]优选地，所述步骤012包括:利用PMMA高分子膜作为载体，在所述已生长了所述石墨烯薄膜的所述铜箔上旋涂PMMA胶体；然后，进行烘烤，使所述PMMA胶体与所述石墨烯薄膜牢固结合，同时所述PMMA胶体中的有机溶剂挥发掉，从而在所述铜箔上形成均匀的PMMA膜；接着，采用化学腐蚀法将所述铜箔腐蚀掉，并将载有所述石墨烯薄膜的所述PMMA膜转移至所述硅衬底上；通过烘烤，使所述石墨烯薄膜与所述硅衬底紧密接触；最后，采用热丙酮去除所述PMMA膜，得到位于所述硅衬底上的所述石墨烯薄膜。
[0034]优选地，所述步骤013包括:
[0035]步骤0131:在所述石墨烯薄膜上形成金属对准标记；
[0036]步骤0132:利用所述金属对准标记，经光刻和刻蚀工艺，使所述石墨烯薄膜形成带状石墨烯，所述带状石墨烯作为所述导电沟道；
[0037]步骤0133:利用所述金属对准标记，在所述带状石墨烯上形成所述源极、所述漏极和所述栅极。
[0038]本发明的基于石墨稀传感器检测MicroRNA的方法，将MicroRNA通过连接分子自组装在石墨稀表面，无需进行标记就可以实现对MicroRNA的检测；并且，石墨稀传感器对MicroRNA的检测的灵敏度较高，制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。
【附图说明】
[0039]图1为本发明的一个较佳实施例的基于石墨烯传感器检测MicroRNA的方法的流程示意图
[0040]图2为本发明的一个较佳实施例的对石墨烯进行改性过程的流程示意图、<