一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，涉及一种用于肿瘤检测的胶体金免疫层析试纸条，为 一种检测P53抗体的试纸条，具体为一种利用噬菌体展示及胶体金层析技术检测血清P53 抗体的试纸条及应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是威胁人类健康的主要杀手，在我国每年新发肿瘤病例为312万例，死亡约 270万。导致这一现象的原因很多，其中一个重要的原因是目前人类还不能对肿瘤的发生发 展过程进行有效的诊断，尤其是早期诊断。
[0003] p53是一种抑癌基因，其蛋白对维持正常的细胞分裂与生长起重要的调节作用，但 是一旦该基因发生突变，编码的突变型蛋白半衰期延长，失去抑癌作用，积累于细胞内则刺 激免疫系统产生相应抗体。研究表明，二十多种常见肿瘤患者血清中可以检测到P53抗体 的存在，并且该抗体可以在肿瘤形成的早期检测到。因此，血清P53抗体可以作为一种广谱 性的肿瘤标志物用于肿瘤早期检测、肿瘤高危人群的筛查及肿瘤患者预后的监视。目前，血 清P53抗体的检测方法主要是ELISA，该方法操作繁琐、耗时长，且包被所用的重组P53蛋白 具有制备繁琐、价格昂贵等缺点。
[0004] 噬菌体展示技术能够将基因型与表现型联系起来，使研究者可以在基因水平上实 现对蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。
[0005] 胶体金免疫层析技术是一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，利用微孔膜的 毛细管作用，使滴加在样品垫上的溶液缓慢经过金标垫、醋酸纤维素（NC膜）到达试纸条的 另一端。该技术具有快速(全部检测过程仅需3-15分钟)、准确、简便、操作简单、稳定性好 等优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测P53抗体的试纸条。
[0007] 本发明所提供的检测P53抗体的试纸条，由依次连接并固定于底板上的样品垫、 胶体金垫、设有检测线和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述样品垫的末端与所述胶体 金垫的始端相连，所述胶体金垫的末端与所述包被膜的始端相连，所述包被膜的末端与所 述吸水垫的始端相连；
[0008] 所述检测线处包被有展示P53蛋白多肽的噬菌体，所述P53蛋白多肽为如下a)或 b)蛋白：
[0009] a)由序列表中序列1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] b)将a)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加，且与P53抗体特异结合的蛋白质；
[0011] 为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的 氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0012] 表：标签的序列
[0013]
[0014] 所述质控线处包被有人IgG;
[0015] 所述胶体金垫上包被有抗所述人IgG的抗体(如羊抗人IgG的抗体）；
[0016] 所述检测线位于所述包被膜靠近所述胶体金垫的一端；
[0017] 所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。
[0018] 在所述试纸条中，所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体具体可按照包括如下步骤的 方法制备得到：
[0019] (al)将所述P53蛋白多肽的编码基因插入到噬菌体载体pfd8SY的酶切位点SacII 和BstBI之间，得到重组噬菌体载体；
[0020] (a2)将所述重组噬菌体载体转化大肠杆菌(如大肠杆菌匪522)，得到重组菌；
[0021] (a3)培养所述重组菌，并向培养体系中加入辅助噬菌体，从而获得所述展示有P53 蛋白多肽的噬菌体。
[0022] 在本发明中，所述（al)中所述重组噬菌体载体具体为：将由单链DNA分子1和单 链DNA分子2互补结合而成的具有粘性末端的双链DNA与经SacII和BstBI双酶切噬菌 体载体pfdSSY所得的骨架载体大片段相连而形成的。
[0023] 所述单链DNA分子1为：
[0024] 5' -GGAGGGTTCTCAAGCTATGGATGATTTAATGTTATCTCCAT-3' ；
[0025] 所述单链DNA分子2为：
[0026] 5, -CGATGGAGATAACATTAAATCATCCATAGCTTGAGAACCCTCCGC-3，。
[0027] 在本发明中，所述（a3)具体为：将所述重组菌加入到含有100iig/mlAmp的LB 液体培养基中至终浓度为l〇ncfu/ml，再加入所述辅助噬菌体至终浓度为0. 05ng/ml， 37°C200rpm(旋转半径为16mm)震荡培养3小时；2599g离心lOmin，弃上清；将沉淀用等 倍体积的新的含有l〇〇yg/mlAmp的LB液体培养基重悬，37°C200rpm(旋转半径为16mm) 震荡培养5小时；5095g离心10mim，将上清按照6 :1的比例加入到PEG/NaCl液体中（即上 清和PEG/NaCl液体的体积配比为6:1 )，4°C静置12-14h;6773g离心30min，弃上清(记为上 清A)，用所述上清A的1/10体积的TE溶液溶解沉淀，16421g离心20min，弃沉淀；向上清 中加入1/6体积的所述PEG/NaCl溶液，4°C静置4h，16421g离心20min，弃上清，所得沉淀即 为所述展示有P53蛋白多肽的噬菌体。
[0028]其中，所述PEG/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：3MNaCl，167g/ LPEG8000。所述TE溶液的溶剂为水，溶质及其浓度为：1.0mMEDTA，10mMTris-HCl，pH8. 0。
[0029] 在如上（al)中，所述P53蛋白多肽的编码基因具体为序列表中序列2所示的DNA 分子。
[0030] 在如上（a3)中，所述辅助噬菌体具体可为M13K07。
[0031] 在所述试纸条上，所述检测线和所述质控线的垂直距离为4-7mm(如5_)。
[0032] 在所述试纸条中，所述样品垫具体可按照包括如下方法制备得到：
[0033] 将玻璃纤维素膜(如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-Y102) 放入样品垫处理液中处理1-2小时(如1小时)，60°C烘干2-4小时(如2小时)，即得所述样 品垫；所述样品垫处理液为含有0. 5%体积分数吐温-20、0. 5g/L叠氮化钠及10g/L牛血清 白蛋白的〇. 1M磷酸盐缓冲液。
[0034] 其中，所述0. 1M磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：80g/LNaCl、2g/ LKCl、29g/LNa2HP03 ? 12H20、2g/LKH2P04,pH7. 2。
[0035] 在所述试纸条中，所述胶体金垫具体可按照包括如下方法制备得到：
[0036] 将标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体(如羊抗人IgG的抗体）铺在玻璃纤维膜 (如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-BX101)上，-80°C孵育1-2小时 (如1小时）后冻干，即得所述胶体金垫。
[0037] 其中，所述"标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体"是按照如下方法制备得到的：
[0038] 用0. 2M碳酸钾水溶液调节胶体金的pH值至9. 0,按照每毫升所述胶体金加入 50-100iig所述抗人IgG的抗体(如羊抗人IgG的抗体）的用量，向所述胶体金中加入所述 抗人IgG的抗体，静置30分钟，然后用金标抗体封闭液封闭30分钟，6773g离心30分钟，弃 上清，将沉淀用金标抗体保存液溶解为原体积(离心前的整个体系的体积）的十分之一，即 得所述"标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体"。
[0039] 其中，所述金标抗体封闭液的溶剂为所述0.01M磷酸盐缓冲液（pH7. 2)，溶质及其 浓度为：l〇〇g/LBSA、10g/LPEG-20000。所述金标抗体保存液的溶剂为所述0.01M磷酸 盐缓冲液（PH7.2)，溶质及其浓度为：10g/LBSA、10g/LPEG-20000、50g/L蔗糖、250iU/L Tween-20。
[0040] 其中，将标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体(如羊抗人IgG的抗体）铺在玻璃纤 维膜（如上海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-BX101)上的铺设密度为：每 毫升所述"标记有胶体金的所述抗人IgG的抗体"铺4平方厘米面积的所述玻璃纤维膜。
[0041] 在所述试纸条中，在所述包被膜(如硝酸纤维素膜）上所述检测线处包被所述展示 有P53蛋白多肽的噬菌体，具体可按照如下方法实现：用包被缓冲液将所述展示有P53蛋白 多肽的噬菌体调节浓度至500-1000iig/ml(如1000iig/ml)，然后使用划膜仪喷在所述检测 线上，50-60°C(如60°C)烘干4-6小时(如4小时）；所述包被缓冲液为0. 05M碳酸盐缓冲 液；所述0. 05M碳酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：1. 6g/LNa2C03, 2. 9g/LNaHC03， pH9. 6〇
[0042] 在所述试纸条中，在所述包被膜(如硝酸纤维素膜）上所述质控线处包被所述 人IgG，具体可按照如下方法实现：用所述0. 01M磷酸盐缓冲液将所述人IgG调节浓度至 500-1000iig/ml(如1000iig/ml)，然后使用划膜仪喷在所述质控线上，50-60°C(如60°C) 烘干4-6小时(如4小时)。
[0043] 在所述试纸条中，所述底板具体可为PVC板；所述吸水垫具体可为吸水滤纸(如上 海杰一生物技术有限公司产品，其产品目录号为JY-X101)。
[0044] 含有所述的试纸条的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0045] 所述试剂盒具体是：为所述试纸条配制可与所述试纸条扣合的且符合如下条件的 盖板后形成的产品：所述盖板上具有与所述样品垫对应的加样窗口，以及与所述检测线和 所述控制线对应的显示窗口。
[0046] 所述试纸条在如下（a)或（b)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0047] (a)检测离体人血清中P53抗体；
[0048] (b)制备癌症检测产品。
[0049] 与现有检测P53抗体的ELISA试剂盒相比，本发明具有以下优点：
[0050] 1.通过免疫胶体金技术，首次将展示P53蛋白优势表位的杂合噬菌体引入到检测 试纸条中，实现P53