一种基于AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于酶的响应的生物传感器、其制备和应用。
【背景技术】
[0002]近些年农药残留引起食物中毒事件时有发生，食品安全对人民的生活、健康造成了极大的威胁。残留农药随着食物链进入人体体内，能够抑制人体内胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质一乙酰胆碱的代谢混乱，引起各类急性、慢性中毒情况，如运动失调、昏迷、瘫痪甚至死亡。有数据显示，有机磷杀虫剂的比例更是占所有农药的70%以上，目前我国粮食、水果、蔬菜产品中农药残留最为严重的就是有机磷和氨基甲酸酯类农药，严重危害人民的健康和安全，因此对有机磷农药进行及时、准确、灵敏的监控和检测，成为亟待解决的迫切问题。
[0003]检测农药的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用、液质联用等，虽然其结果精确、可靠，但所需设备复杂昂贵，需专业人员操作且费时麻烦，不适应现场快速检测需要。也有一些的快速检测方法例如试纸法、显色法、光度法等虽然操作简单、成本低，但是其检出限、灵敏度又不太理想。近些年来酶生物传感器的出现给农药检测提供了新的思路，与传统检测方法和其他快速检测方法相比酶生物传感器具有分析速度快、成本低、选择性好、灵敏度高等优点。
[0004]传统酶生物传感器采用的固定方法是随机将AChE酶与载体结合，当结合位点靠近活性中心，会使酶部分甚至是全部丧失催化活力，从而导致酶生物传感器性能不好。因此，发展一种能克服上述缺陷、且灵敏度高、酶活性高、稳定性好的AChE生物传感器具有重要意义。
【发明内容】
[0005]针对本领域的不足之处，本发明的目的是提出一种基于AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法。
[0006]本发明的第二个目的是提出所述制备方法得到的基于AChE酶定向固定的生物传感器。
[0007]本发明的第三个目的是提出所述基于AChE酶定向固定的生物传感器的应用。
[0008]实现本发明上述目的技术方案为:
[0009]—种基于AChE酶定向固定的生物传感器的制备方法，包括步骤:
[0010]I)玻碳电极表面修饰:玻碳电极在硫酸溶液中用循环伏安法活化，然后以壳聚糖修饰电极表面；
[0011]2)儿茶素固定:将步骤I)制得的壳聚糖修饰的玻碳电极置于三聚氯氰溶液中，-5°C?5°C温度下处理I?3小时得到连接臂三聚氯氰固定的电极，然后再将所述连接臂三聚氯氰固定的电极置于儿茶素溶液中30°C?40°C温度下处理2?4小时；
[0012]3) AChE酶定向固定:溶解AChE所用溶液为PBS缓冲溶液和甘油体积比为2?4:2的混合溶液，PBS缓冲溶液的pH = 7.0?7.8 ;每ImL所述混合溶液中溶解500U的AChE，然后用于修饰步骤2)固定了儿茶素的电极的表面。
[0013]其中，所述步骤I)中，玻碳电极首先以Al2O3浆抛光，然后蒸馏水冲洗、超声清洗，再依次在硝酸、乙醇、水中超声清洗，用氮气吹干。用于清洗的硝酸通常用市购硝酸与水配成体积比1:1?2的溶液。
[0014]用于抛光Al2O3浆优选采用不同粒径的Al 203,可先后采用粒径lOOOnm、300nm、50nm的Al2O3进行抛光。
[0015]进一步地，所述步骤I)中，玻碳电极在0.1?1.0mol/L硫酸溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.6?1.0￥，扫描速度为501^/8 ;扫描后在0.lmol/L KCl中记录1X10 3mol/L的K3Fe (CN)fr^液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/s，扫描范围-0.2?0.8V ;当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mv以内，所述玻碳电极处理成功，否则重新返回用循环伏安法活化步骤中。
[0016]优选地，所述步骤I)中壳聚糖为溶液形式，滴涂到玻碳电极表面，然后干燥；壳聚糖溶液是将I?1g壳聚糖放入10ml质量分数I %的醋酸溶液中配制而得。更优选地，壳聚糖浓度为5% (5g壳聚糖放入10ml醋酸溶液)。
[0017]其中，每平方毫米玻碳电极修饰壳聚糖溶液的体积为0.2?2 μ L。
[0018]其中，所述步骤2)中的三聚氯氰溶液为按照质量体积比0.05g: 10?20mL三聚氯氰溶于丙酮的溶液。
[0019]其中，所述步骤2)中的儿茶素溶液为按照质量体积比0.05g: 10?20mL儿茶素溶于丙酮的溶液。
[0020]进一步地，所述步骤3)中固定了儿茶素的电极用超纯水清洗后干燥，取溶解了AChE酶的溶液滴涂到电极表面，每平方毫米玻碳电极滴涂溶液的体积为0.2?2 μ L，然后将电极置于O?5°C温度下10?20小时，得到基于AChE酶定向固定的生物传感器。
[0021 ] 本发明提出了生物传感器的制备方法，并提出对所制备的传感器的表征和性能检测方法。具体为:
[0022]以所述生物传感器为工作电极、对电极为铂、金、银电极中的一种，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极系统，用交流阻抗法、循环伏安法、计时电流法中的一种或多种方法检验制得的生物传感器的性能；
[0023]所述交流阻抗法为:将三电极系统置于含有5mmol/L(即Fe3+:Fe 2+浓度均为5X103mol/L)l:lFe3+:Fe2+的 0.lmol/L KCl 电解液中，电压值 0.168v，电压频率范围:10 1?10 5，测交流阻抗谱；对每步修饰进行表征是每修饰一步检测一次。
[0024]所述循环伏安法为:将三电极系统置于ATCl溶液中，扫描范围为-0.6?1.0V,扫描速度为50mV/s，得到循环伏安图。
[0025]所述计时电流法为:将三电极系统放于空白PBS溶液中(0.1MpH = 7.5)，检测电位:0.68v，扫描时间600s，间歇加入ATC1，得到计时电流图，根据响应电流跟加入ATCL的量做出来的线性曲线算出灵敏度。
[0026]本发明所述的制备方法制得的生物传感器。
[0027]本发明所述生物传感器在检测有机磷农药中的应用。
[0028]本发明的有益效果在于:
[0029]本发明通过采用壳聚糖修饰玻碳电极，充分利用壳聚糖分子的高比表面积、良好的吸附能力和优良的生物相容性。使用三聚氯氰作为一种连接儿茶素的连接臂，因为它的三个氯原子受C = N不饱和键的影响活性增强，三个氯原子的反应活性都比较高(相当于酰氯的活性)，容易发生亲核取代反应，容易与-0H、-NH2、-SH、-NHR等含活泼氢的官能团反应。本发明通过使用儿茶素作为一种定向固定分子，通过与AChE的催化活性中心相对的位置的特异性结合将酶定向的固定在电极表面，从而实现固定酶量提高，促使AChE生物传感器稳定性提高；酶催化中心的完全暴露，促使AChE催化活力高，最终得到一种新型、灵敏、酶活性高、稳定性好的AChE生物传感器。
【附图说明】
[0030]图1为本发明制备方法的流程图。
[0031]图2为实施例1得到的不同修饰的玻碳电极的交流阻抗图谱。
[0032]图3为实施例1得到的不同种酶传感器检测底物乙酰胆碱产生的电流响应。
[0033]图4为实施例1得到的酶传感器在固定电位下检测不同浓度的乙酰胆碱产生的1-T 图。
[0034]图中，GCE表示玻碳电极，CS表示壳聚糖，CC表示三聚氯氰，CA表示儿茶素，AchE表示乙酰胆碱酯酶。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。
[0036]如未特别说明，【具体实施方式】中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。
[0037]实施例1
[0038]流程如图1。
[0039]第一步:玻碳电极表面修饰(玻碳电极直径3mm):
[0040]I)壳聚糖溶液的制备:称取5g壳聚糖，放入10ml I %的醋酸溶液中，将溶液在超声中超声I小时得到5%的壳聚糖溶液，置于4°C冰箱中保存。
[0041]2)清洗:所述玻碳电极修饰前，分别使用lOOOnm、300nm、50nm的Al2O3楽在麂皮上抛光至镜面，使用蒸馏水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次l_2min，重复三次，最后依次在1:1硝酸、乙醇和超纯水中超声清洗5min，使用氮气吹干，备用。
[0042]3)测试:清洗后的所述的玻碳电极放入0.5M硫酸溶液中用循环伏安法活化，扫描范围为-0.6?1.0￥，扫描速度为501^/8，扫描10圈得到稳定的循环伏安图；最后在0.lmol/L KCl中记录IX 10 3mol/L的K3Fe (CN)fr^液的循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/s，扫描范围-0.2?0.8V ;得到的循环伏安曲线中的峰电位差在SOmv左右，说明玻碳电极处理成功。否则需要重新进行步骤2)和步骤3)，处理玻碳电极直到符合要求。
[0043]4)修饰:取5 μ I的5 %的壳聚糖溶液滴涂到电极表面，然后放于红外灯下烘干。得到壳聚糖修饰电极。
[0044]第二步:儿茶素固定:
[0045]I)称取0.05g三聚氯氰，溶解在装有15ml丙酮的三口圆底烧瓶中。将烧瓶放于(TC冰浴中，搅拌5分钟，使三聚氯氰固体完全溶解。
[0046]2)将壳聚糖修饰的玻碳电极使用丙酮溶液冲洗三次，然后将