基于间四苯基卟啉锌的电致化学发光体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于电化学分析检测技术领域，具体涉及一种基于间四苯基卟啉锌的电致化学发光体、制备方法及其在DNA检测中的应用。
【背景技术】
[0002]电致化学发光(electrochemiluminescence，ECL)以高灵敏度和低背景著称，作为一种强大的分析手段，目前已应用于食品卫生医疗行业。ECL的灵敏度本质上取决于发光体的发光效率。其中，阴极电致发光体以半导体纳米晶体占主导地位，但该类物质一般含有毒成分，且ECL强度不高并依赖外源性强氧化剂作为共反应剂增敏，极大限制ECL技术的更广泛使用。因此寻找高效的阴极ECL发光体、并利用其发展简易、稳定的ECL检测方法，十分必要。
[0003]卟啉分子由于其特殊的电化学活性，已被广泛应用于光电传感器和电化学分析中。间四苯基卟啉锌(ZnTPP)在以溶解氧作为共反应剂的条件下，具有高效优良的电致化学发光响应，且具有较好稳定性，不发生任何光漂白反应。
[0004]血红素中铁卟啉中心金属原子与组氨酸咪唑环上游离N原子可发生轴向配位。Chitta等人基于JT-JT共轭方式将碳纳米管与含共轭基团化合物如芘丁酸连接，并通过花丁酸衍生物末端咪卩坐环N原子孤对电子与金属卟啉轴向配位设计并合成了一种纳米复合物，发现该复合物具有一定的光致电荷分离和传递作用(Chitta R, Sandanayaka AS D，Schumacher A L，et al.Donor-acceptor nanohybrids of zinc naphthalocyanineor zinc porphyrin noncovalentIy linked to single-walI carbon nanotubesfor photoinduced electron transfer[J].The Journal of Physical ChemistryC，2007，111(19):6947-6955)。然而，光致发光材料并不一定能够实现电致发光。
[0005]目前被研究最多的电致化学发光体包括钌联吡啶(Ru(bpy)32+)、鲁米诺和量子点等。以钌联吡啶为例，其价格昂贵，存在着被不断消耗引发分析成本高、环境污染和实验装置复杂等系列问题，同时其在应用中需要添加以三丙胺作为共反应剂，而后者易致毒且对环境有害，使钌联吡啶的应用受到一定的限制。卟啉源于血红蛋白和叶绿素，本身具有优异的安全性和生物相容性，此外不需要另外的共反应剂，只需在有氧环境下即可实现较强的电致发光信号。现有技术中通常利用卟啉及其衍生物的光电性能，进行光电仿生方面研究，例如太阳能电池板的吸光材料等。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种制作简便的新型电致化学发光体及其制备方法，以苯胺咪卩坐(4-(lH-1midazol-l-yl)Aniline, ImAn)桥接足球稀卩比略烧三羧酸(C60pyrrolidine tris-acid, C60-(C00H)3)并轴向配位间四苯基卩卜啉锌的纳米团簇作为新型电致化学发光体，并利用环糊精包被该纳米团簇，设计了一种高选择性、简易的ECL传感体系，并应用于电致化学发光检测DNA。
[0007]为了实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0008]—种基于间四苯基B卜啉锌的电致化学发光体，该发光体为C60-1mAn-ZnTPP,由苯胺咪唑、足球烯吡咯烷三羧酸和间四苯基卟啉锌组成，所述的苯胺咪唑桥接足球烯吡咯烷三羧酸并轴向配位间四苯基卟啉锌。
[0009]—种制备上述发光体的方法，具体步骤如下:
[0010](I)依次将足球烯吡咯烷三羧酸、N-乙基-V -(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺(N-Ethyl-N ' - (3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimide hydrochloride, EDC)、N-轻基丁二酰亚胺(N-HydroxySuccinimide, NHS)和苯胺咪卩坐加入到二氯甲烧(DiChloroMethane, DCM)中，隔绝空气搅拌反应完全，反应结束后透析处理，除去未反应完全的反应物；
[0011](2)将与苯胺咪唑等摩尔量的间四苯基卟啉锌加入到步骤I中经透析后的溶液中，密封避光，搅拌反应完全，反应结束后透析处理，除去未反应完全的反应物，干燥即得以苯胺咪唑桥接足球烯吡咯烷三羧酸并轴向配位间四苯基卟啉锌的电致化学发光体(C60-1mAn-ZnTPP)。
[0012]步骤I中，所述的EDC与NHS的摩尔比为4?1:1，所述的足球烯吡咯烷三羧酸与苯胺咪唑的摩尔比为1:3?6。
[0013]所述的透析处理为反应结束后将反应液转入透析袋中，以DCM为透析液，每隔2?3h更换，室温透析3?4天，其中，步骤I中的透析处理的透析袋的截留分子量为1000，步骤2中的透析处理的透析袋的截留分子量为2000。
[0014]上述发光体在DNA检测中的应用，包括如下步骤:
[0015](I)依次将 2wt.% 聚二稀丙基二甲基氯化钱(PolyDiallylDimethylAmmonium, PDDA)的水溶液和纳米金溶液滴涂在玻碳电极表面，然后在电极表面滴涂含有捕获DNA(cDNA)的三(2-羧基乙基)膦(Tris (2-CarboxyEthyI) Phosphine, TCEP)溶液，37°C温育箱中静置，随后置于4°C、饱和湿度条件下过夜；
[0016](2)PBS淋洗电极，除去未固定的cDNA，随后滴涂2wt.%的牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin, BSA)水溶液，封闭活性位点以防非特异性吸附，并置于37°C温育，取出后淋洗；
[0017](3)将含待测目标DNA (tDNA)的TCEP溶液滴涂在步骤2得到的电极表面，置于37°C下反应，反应完成后淋洗；
[0018](4)配制EDC和NHS的混合溶液，再与2_己二胺基-β -环糊精(2_HexyldiAminο- β -CycloDextrin, β -CDNH2)的饱和甲醇溶液等体积混合，得EDC/NHS/ β -CDMV混合溶液，然后将H)C/NHS/ β -CDMV混合溶液滴涂在上述步骤3得到的电极表面，室温下酰胺化反应;
[0019](5)配制C6Q-1mAn-ZnTPP的乙醇溶液，随后将C6Q-1mAn_ZnTPP的乙醇溶液滴涂在步骤4得到的电极表面，室温下反应；
[0020](6)以步骤5得到的电极为工作电极，在以四丁基高氯酸钱(TetrabutylammoniumPerchlorate, TBAP)作为电介质的DCM溶液中采用循环伏安法检测ECL信号，最后根据tDNA浓度对数值与ECL信号变化值的线性方程计算出tDNA的浓度，进而得出待测液中tDNA的含量。
[0021]步骤I中，所述的捕获DNA的浓度范围为I μΜ?10 μΜ。
[0022]步骤5中，所述的C6Q-1mAn-ZnTPP的乙醇溶液的浓度范围为0.5mM?ImM。
[0023]步骤6中，所述的检测ECL信号的方法为:以步骤5得到的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，调节电位为-2.2?0V，扫描速度为10mV S 四丁基高氯酸铵的DCM溶液的浓度为0.1M。
[0024]通过调整捕获DNA的碱基序列，本发明所提供的方法可以根据目标DNA的碱基进行适应性调整，从而满足各种不同的DNA检测要求。
[0025]本发明与现有技术相比，其显著优点是:(I)采用足球烯吡咯烷三羧酸作为原料，足球烯吡咯烷三羧酸作为一种碳纳米材料，具有优异的导电性能，与卟啉化合物桥接，可提高化合物的电荷分离及传递效率，此外具有的三个羧基可以实现三个卟啉的富集，实现信号的放大；(2)发光体制备过程简单快速，无毒无害，制得的电致化学发光体直接以空气作为共反应剂，具有较佳的电致化学发光响应，可作为通用的简易的信号标记；(3)利用β -环糊精包被该发光体，应用于电致化学发光DNA检测中，检测方法简便，可控性、选择性和重现性好，灵敏度高，检测限低，信号稳定，平行试验及同条件不同批次下输出的ECL信号相对标准偏差仅为8%和10%。
【附图说明】
[0026]图1为本发明制备新型电致化学发光体及用于特异性检测DNA产生ECL信号的示意图。
[0027]图2为实施例4得到的C6Q-1mAn-ZnTPP电致化学发光体(a)、ZnTPP (b)、C60(COOH)3(C)的紫外光谱表征图。
[0028]图3为实施例5得到的C6Q-1mAn-ZnTPP电致化学发光体(a)、ZnTPP (b)，C60(COOH)3(C)的电致化学发光图谱，内插图为ECL光强随时间稳定性图谱。
[0029]图4为实施例6得到的β -环糊精包被C6(]-1mAn-ZnTPP电致化学发光体H)DA+AuNPs+β -CDSH+C6Q-1mAn-ZnTP