蛇胆川贝液的标准特征图谱的构建及其质量检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及中成药的质量控制技术，具体涉及一种蛇胆川贝液的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 蛇胆川贝液是一种上市多年的中成药，有无糖型和有糖型两种，现行执行标准是 国家药品标准WS3-B-1832-94-2011。蛇胆川贝液是由原料蛇胆汁、平贝母和杏仁水经提取 精制配制而成，其具有祛风止咳、除痰散结功效，用于治疗风热咳嗽、痰多气喘、胸闷、咳痰 不爽或久咳不止等。
[0003] 目前，对蛇胆川贝液的质量控制方法主要是蛇胆汁和平贝母药材的薄层鉴别、以 及氢氰酸和牛磺胆酸的含量测定，该方法虽能在一定程度上控制蛇胆川贝液的质量，但还 是无法全面的反映其质量状况，例如，蛇胆汁中所含有的活性成分很多，只用牛磺胆酸这个 指标来评价和控制产品的质量明显不足。为了弥补现有蛇胆川贝液的质量控制方法的缺 陷，有必要构建该产品的标准特征图谱，以便于更好地进行该产品的质量控制。
[0004] 经查阅资料可知，发明名称为"一种利用特征图谱控制牛黄蛇胆川贝胶囊里蛇胆 汁质量的方法（申请号为CN103149288A)的专利公开了一种牛黄蛇胆川贝胶囊里蛇胆汁特 征图谱的检测方法，其是以0. 4%甲醇和磷酸二氢钾按7:3的体积比混合作为流动相、检测 波长为205nm进行蛇胆汁的特征图谱的检测，牛黄蛇胆川贝胶囊公开的标准处方是由人工 牛黄、蛇胆汁和川贝母组成，具体制备方法是先将川贝母粉碎成细粉，然后与人工牛黄、蛇 胆汁混勾，最后干燥、粉碎、过筛、装入胶囊，即得。经对比可知，牛黄蛇胆川贝胶囊与蛇胆川 贝液的处方组成以及制备方法完全不同，且所含活性成分也不同。申请人曾采用上述控制 牛黄蛇胆川贝胶囊里蛇胆汁质量的方法检测蛇胆川贝液的特征图谱，结果色谱峰较少，也 即是说直接采用上述方法无法实现对蛇胆川贝液的质量控制提供依据，因此，如何对蛇胆 川贝液的特征图谱进行有效测定，进而为蛇胆川贝液的质量检测控制提供依据，这是目前 尚需解决的技术瓶颈。
[0005] 发明目的
[0006] 本发明的首要目的是提供一种操作方便、重现性好、精密度高的蛇胆川贝液的标 准特征图谱的构建方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种蛇胆川贝液的标准特征图谱 的构建方法，其步骤如下：
[0008] a)标样溶液、参照物溶液的准备：将至少20批次合格的蛇胆川贝液分别浸提得到 各标样溶液，将牛黄胆酸钠对照品加甲醇制成参照物溶液；
[0009] b)高效液相色谱分析：精密吸取等量的各标样溶液、参照物溶液，分别注入液相 色谱仪进行测定，即得各标样溶液和参照物溶液的色谱图；
[0010] c)标准特征图谱的构建：将得到的各标样溶液的色谱图导入中药色谱指纹图谱 相似度评价系统，制定得到蛇胆川贝液的标准特征图谱。该标准特征图谱中有8个特征峰， 按出现的时间顺序将所述的8个特征峰依次编号1~3、S、4~7,以参照物溶液的色谱峰的 相对保留时间为1，计算得知1~7号特征峰的平均相对保留时间分别为0. 52、0. 86、0. 91、 I. 10、I. 21、I. 76、I. 93 ;所述的S号色谱峰是牛黄胆酸钠的特征峰，其平均相对保留时间为 1〇
[0011] 本发明公开的蛇胆川贝液的标准特征图谱的构建方法是申请人经多年的试验研 究获得，其完善、科学，采用该方法构建的标准特征图谱中的8个特征峰的分离度高，为后 续蛇胆川贝液产品的质量检测有效地提供了数据基础，进而为蛇胆川贝液今后的标准化生 产提供一种可行的质量控制模式。具体说来，本发明是将合格的各蛇胆川贝液制得的标样 溶液与牛黄胆酸钠对照品制得的参照物溶液在规定的实验条件下测定分析得到色谱图，这 样将牛黄胆酸钠对照品的色谱图与合格的各蛇胆川贝液的色谱图进行比对，从而可以确定 两者之间的共有特征峰，亦即找出各蛇胆川贝液测得的色谱图上的牛黄胆酸钠的特征峰， 从而以牛黄胆酸钠特征峰的相对保留时间为1，计算出各蛇胆川贝液的色谱图上其他特征 峰的相对保留时间，进而为后续的待测蛇胆川贝液产品的质量检测提供数据基础。
[0012] 上述记载的合格的蛇胆川贝液也可以理解为是标准蛇胆川贝液，其是质量完全符 合国家相关标准的蛇胆川贝液。
[0013] 具体的方案为，高效液相色谱分析的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4. 6mm,粒径5 μ m);以甲醇为流动相A，以0· 04~ 0. 4%的磷酸二氢钾溶液为流动相B，流动相按体积比为30~56 :70~44的A相和B相梯 度洗脱，所述的磷酸二氢钾溶液用磷酸调至PH值为3. 0 ;流速0. 5~I. 5ml/min ;检测波长 205±2nm ;柱温30~40°C ;进样液的进样量为10-20 μ 1 ;按照牛黄胆酸钠峰计算，理论塔 板数彡7000。
[0014] 作为进一步的优选方案，所述的A相为色谱级甲醇；梯度洗脱的时间及流动相比 例为：0 ~lOmin，A 相 30%- 35%，B 相 70%- 65% ;10 ~20min，A 相 35%- 56%，B 相 65%- 44% ;20 ~60min，A 相 56%，B 相 44%。
[0015] 实际在制备标样溶液和参照物溶液时，优选方案是取20批合格的蛇胆川贝液分 别进行浸提操作，蛇胆川贝液的浸提步骤为：向蛇胆川贝液中加8~10倍体积的40%~ 50%甲醇，稀释，摇匀，室温静置10~30分钟，滤过，取续滤液即为标样溶液；优选的，取20 批合格的蛇胆川贝液分别进行浸提操作，蛇胆川贝液的浸提步骤为：向蛇胆川贝液中加9 倍体积的50%甲醇，稀释，摇匀，室温静置20分钟，滤过，取续滤液即为标样溶液；具体的浸 提操作为：精密吸取蛇胆川贝液lml，置IOml量瓶中，加40% -50%甲醇稀释至刻度，摇匀， 室温静置10-30分钟，滤过，取续滤液即为标样溶液。按上述限定参数进行操作制取的标样 溶液中各组分的分离效果最好，测得的蛇胆川贝液的色谱图也最为准确。
[0016] 另外，参照物溶液的制备步骤为：取牛磺胆酸钠对照品，加甲醇制成每1ml含 0.1 mg~0. 5mg的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液；优选的，参照物溶液的制备步骤 为：取牛磺胆酸钠对照品，加甲醇制成每1ml含0. 3mg的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶 液。
[0017] 本发明的另一个目的是基于以上方法构建的蛇胆川贝液的标准特征图谱，提供一 种蛇胆川贝液的质量检测方法。
[0018] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种蛇胆川贝液的质量检测方法， 其步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测蛇胆川贝液的色谱图 和对照品牛黄胆酸钠的色谱图，将待测蛇胆川贝液的色谱图与构建的标准特征图谱比对， 若待测蛇胆川贝液的色谱图中出现标准特征图谱中相同的8个特征峰，与参照物峰相应的 峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。各特征峰的相对保留时间与标准特征图 谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5%以内，则该蛇胆川贝液的质量合格， 反之则不合格，如此可以实现快速检测判断蛇胆川贝液的质量。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例1测得的牛黄胆酸钠的色谱图；
[0020] 图2为实施例1测得的标准蛇胆川贝液的色谱图；
[0021] 图3为实施例1中测得的20批标准蛇胆川贝液的色谱图导入中药色谱指纹图谱 相似度评价系统中进行分析导出的截图；
[0022] 图4为实施例1制定得到的蛇胆川贝液的标准特征图谱。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例1-3对本发明公开的技术方案作进一步的说明：
[0024] 实施例1 :蛇胆川贝液的标准特征图谱的构建
[0025] 1、仪器与药品
[0026] 仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。
[0027] 药品：磷酸（分析纯）；甲醇（色谱级，SIGAMA) ;20批标准蛇胆川贝液（无糖型）由 安徽安科余良卿药业有限公司提供，批号分别为20140305、20140408、20140603、20140708、 20140803、20140902、20140906、20141202、20150107、20150112、20150116、20150202、 20150304、20150307、20150313、20150317、20150320、20150322、20150408、20150503,上述 20批标准蛇胆川贝液依次编号为Sl~S20 ;牛磺胆酸钠对照品（纯度88. 9% )，批号为 110815-200506。
[0028] 2、色谱条件
[0029] 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4. 6mm,粒径 5 y m);以甲醇为流动相A，以0. 4%的磷酸二氢钾溶液为流动相B，流动相按体积比为30~ 56 :70~44的A相和B相梯度洗脱，所述的磷酸二氢钾溶液用磷酸调至pH值为3. 0,梯度 洗脱的时间及流动相比例为：0~1011^11，4相30%-35%，8相70%-65% ;10~201^11， A 相 35%- 56%，B 相 65%- 44% ;20 ~60min，A 相 56%，B 相 44% ;流速 1.0 ml/min ;检 测波长205nm ;柱温30~40°C ;进样液的进样量为10 μ 1 ;按照牛黄胆酸钠峰计算，理论塔 板数彡7000。
[0030] 3、标准特征图谱的特征峰的测定
[0031] 3. 1标准特征图谱的构建
[0032] (1)标样溶液的制备：精密吸取20批标准蛇胆川贝液（无糖型）各1ml，分别置 IOml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，室温静置20分钟，滤过，取续滤液即得20个标 样溶液。
[0033] (2)参照物溶液的制备：取牛磺胆酸钠对照品50mg，置100mL量瓶中，加甲醇稀释 至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液。
[0034] (3)高效液相色谱分析：分别精密吸取参照物溶液和标样溶液各10 μ 1，分别注入 液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得牛黄胆酸钠对照品的色谱图（见图1)和 标准蛇胆川贝液的色谱图（见图2,批号为20150503的无糖型标准蛇胆川贝液的色谱图）。
[0035] (4)标准特征图谱的构建
[0036] 将检测得到的20批标准蛇胆川贝液（无糖型）的色谱图导入中药色谱指纹图谱 相似度评价系统，相应操作后得到如图3所示的标准蛇胆川贝液的特征图谱，图3中的R号 图谱为系统生成的对照图谱，导出即得如图4所示的标准蛇胆川贝液的标准特征图谱。
[0037] 3. 2标准特征图谱中特征峰的确定
[0038] 经比较20批标准蛇胆川贝液（无糖型）色谱图和牛黄胆酸钠的色谱图，确定蛇 胆川贝液的色谱图中有8个特征峰，按出现的时间顺序将这8个特征峰依次编号1~3、S、 4~7,其中S号色谱峰为牛黄胆酸钠的特征峰，设定S号峰的相对保留时间为1，计算其他 7个峰的相对保留时间，结果如表1所示。经计算，1~7号峰的平均相对保留时间分别为： 0· 52、0· 86、0· 91、1· 10、1· 21、1· 76、1· 93,相对标准差均彡 0· 5