细胞介导的免疫应答试验的制作方法

文档序号:9332515阅读:582来源:国知局
细胞介导的免疫应答试验的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般涉及基于免疫学的试验领域,并描述了用于测量细胞介导的免疫应答 力的方法。本发明教导了用于测定细胞介导的免疫应答活性的方法、组合物和试剂盒,其具 有增强的灵敏性和改善的储存稳定性。
[0002] 发明背景
[0003] 基于免疫学的诊断试验在医疗领域具有广泛应用。具体而言,其是辅助检测和监 测多种疾病病症的重要工具。这些试验类型的效果部分在于免疫系统内组分(如T淋巴细 胞)的特异性。尽管有这样的特异性,但对于在具有活性或潜伏感染疾病状态的对象或表 现出免疫缺陷或任何形式的免疫抑制的对象中检测感染、检测是否存在低级感染(持续低 水平感染)而言,基于免疫学的诊断不总是足够灵敏的。细胞介导的免疫应答试验的所需 性能特征,尤其是对于检测抗原特异性T细胞应答而言,包括合适的灵敏性、特异性、可靠 性和再现性,此外还应简单和快速地进行操作。
[0004] 一种已建立的基于免疫学的诊断试验形式涉及使用抗原刺激T细胞或免疫系统 的其他细胞,随后检测应答抗原刺激而生成的免疫效应分子(如IFN-Y或其他细胞因 子)。使用熟知的技术检测免疫效应分子,如酶免疫试验、多元珠分析、ELISA、ELISpot和 流式细胞术。还可基于RNA水平测定免疫效应分子是否存在或其水平的升高。这类试 验可例如用于检测疾病特异性免疫应答,特别是病原体特异性免疫应答。各试验在商标 QuantiFERON(注册商标,塞尔雷斯蒂斯有限公司(Cellestis Limited))下市售可得且可 例如用于诊断病原体感染或监测针对疾病的细胞介导的免疫。
[0005] 各细胞介导的免疫应答试验的其他应用包括分析或监测针对疫苗或免疫治疗 (如癌症免疫治疗)的细胞免疫应答。
[0006] 非常需要具有增强的灵敏性的各试验。先前,通过将样品(如全血样品)与抗原在 单糖(如右旋糖)存在的情况下进行孵育来改善用于测量细胞介导的免疫应答的方法(参 见例如WO 2004/042396 Al)。已发现,单糖(如右旋糖和葡萄糖)增加由免疫细胞产生的 IFN-γ并由此改善试验的灵敏性。对于允许细胞利用该能量源并因此受益于在与抗原孵育 期间添加糖而言,单糖(如右旋糖和葡萄糖)的使用被认为是必要的。在除抗原外向样品 中直接添加单糖时,观察到INF-γ水平的显著升高。然而,为简化方法的实施,优选提供即 用型试剂组合物并避免手动操作步骤。因此,需要提供包含抗原和单糖的单个组合物。所 述组合物可在样品收集管中提供,其中样品以正确浓度直接接触抗原和单糖,从而避免操 作误差。然而在本文中发现,当包含抗原和单糖的各样品收集管在室温下或升高的温度下 储存时,试验活性随时间减少。这发现于使用某些抗原时。因此,这些试剂盒组分的储藏期 有限,且在一段储存时间后,该试验仅提供低灵敏度或者甚至试验活性完全丧失。因此,各 试剂盒/试验材料(其中在一个组合物中方便地提供抗原与单糖)不是储存稳定的,且因 此具有试验灵敏度随时间降低或甚至丧失的风险。当样品收集管内未包含单糖与抗原,但 单糖单独地添加至样品以与抗原孵育时,未观察到上述现象。
[0007] 本发明的目的是克服现有技术方法的至少一个缺陷。具体而言,本发明的目的是 提供灵敏且可靠的方法来测量细胞介导的免疫应答以及储存稳定的试剂盒和试剂盒组分。

【发明内容】

[0008] 发明人发现,在样品与抗原孵育期间添加非还原糖出乎意料地增加了应答水平并 因此提高了该方法的灵敏度,其类似于在孵育期间添加单糖(如右旋糖和葡萄糖)所见的 现象。这是预料之外的,因为先前认为仅可以使用单糖并因此使用代表还原糖的单糖来实 现灵敏度的升高。此外,还出乎意料地发现,该方法即使在延长的试验材料储存期间也可维 持其增加的灵敏度,即使在以单一组合物的形式提供非还原糖和抗原时也是如此。因此,发 明人出乎意料地发现,使用非还原糖代替单糖显著增加了试验组分的储存稳定性,同时提 高了应答水平并因此可改善试验灵敏度。不受理论的束缚,认为非还原糖在阳性细胞介导 的免疫应答的情况下增加了释放的免疫效应分子的量,从而改善试验灵敏度。显然,免疫效 应分子产生得到增强。因此,如本文所述使用非还原糖还可比其它可能的方法更早地监测 到免疫细胞刺激。提高细胞介导的免疫应答试验的灵敏度的能力还可促使使用较低灵敏度 的效应分子监测方法和/或使用较小的样本量。此外,这些有益效果还可在延长的试验材 料储存后获得,从而改善试验的可靠性和再现性。
[0009] 根据第一方面,提供了用于测量细胞介导的免疫应答活性的方法,所述方法包括 [0010] (a)通过使包含免疫细胞的样品接触至少一种抗原和至少一种非还原糖来提供孵 育组合物,所述免疫细胞能够在由抗原进行刺激后产生免疫效应分子,以及
[0011] (b)检测是否存在免疫效应分子或其水平。
[0012] 可使用所述方法例如以测量对象(如患者)中细胞介导的免疫应答活性。存在 (或不存在)检测到的免疫效应分子或其水平表示对象针对测试的抗原产生细胞介导的免 疫应答的水平或能力。
[0013] 根据第二方面,提供了用于诱导细胞介导的免疫应答的组合物,所述组合物包含
[0014] a)至少一种抗原;
[0015] b)至少一种非还原糖;以及
[0016] c)可选的至少一种抗凝血剂。
[0017] 组合物可各自方便地用于本发明的第一方面所述的方法中以通过使包含免疫细 胞的样品接触所述组合物来制备孵育组合物。
[0018] 根据第三方面,提供了一种样品收集容器,其包含本发明的第二方面所述的组合 物。该样品收集容器可方便地用于本发明的第一方面所述的方法中。优选地,该样品收集 容器是真空的血液收集管。
[0019] 根据第四方面,提供了用于测量对象中细胞介导的免疫应答活性的试剂盒,其包 含至少一种抗原、至少一种非还原糖、至少一个样品收集容器(其优选是血液收集管)和至 少一种针对至少一种免疫效应分子的检测手段。试剂盒可各自用于进行本发明的第一方面 所述的方法。
[0020] 根据第五方面,本发明涉及非还原糖在用于测量细胞介导的应答活性的免疫试验 中的应用,其中,非还原糖的添加增加了免疫细胞中至少一种免疫效应分子(优选IFN-γ) 的释放,所述免疫细胞对所述试验中测试的抗原产生应答。
[0021] 根据下述说明和所附权利要求,本发明的其它目的、特征、优点和方面对本领域技 术人员而言是显而易见的。然而,应理解,尽管下述说明、所附权利要求和特定实施例表示 所述应用的优选实施方式,其也仅以说明方式给出。通过阅读下文,落在所述公开的发明的 精神和范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0022] 附图简要说明
[0023] 图I =QFN-CMV试验中添加海藻糖对于IFN- γ应答的影响。
[0024] (**p〈0. 01 ;***ρ〈0· 001)
[0025] 图2 =QFN-TB试验中添加海藻糖对于IFN- γ应答的影响。
[0026] 图3 :四种不同非还原糖增加定量QFN CMV结果。
[0027] 发明详述
[0028] 通篇说明书中,除非内容需要另外说明,否则,术语"包括"或其变体如"包含"或 "含有"应理解为指示包括所述元件或整数或方法步骤或者元件或整数或方法步骤的组而 不排除任何其它元件或整数或方法步骤或者元件或整数或方法步骤的组。
[0029] 本说明书所用的单数形式"一个"、"一种"和"该(所述)"包括复数事物,除非上 下文另有明确说明。因此,例如,提及"Τ细胞"包括单个T细胞,和两个或更多T细胞;提 及"抗原"包括单一抗原,和两种或更多抗原。同样,提及"剂","试剂","分子"和"化合物" 包括单个实体和两个或多个这类实体的组合。提及"公开"包括由本公开文件教导的单个 或多个方面;等。本文教导的各方面由术语"发明"包括。本发明的所有方面都在本权利要 求允许范围内。
[0030] 根据第一方面,提供了用于测量细胞介导的免疫应答活性的方法,所述方法包括
[0031] (a)通过使包含免疫细胞的样品接触至少一种抗原和至少一种非还原糖来提供孵 育组合物,所述免疫细胞能够在由抗原进行刺激后产生免疫效应分子,以及
[0032] (b)检测是否存在免疫效应分子或其水平。
[0033] 本文描述了所述方法的有利实施方式和应用。根据第一方面的一个实施方式,提 供了用于测量对象中细胞介导的免疫应答活性的方法,所述方法包括
[0034] (a)通过使包含免疫细胞的样品接触至少一种抗原和至少一种非还原糖来提供孵 育疫组合物,所述免疫细胞能够在由获自对象的抗原进行刺激后产生免疫效应分子,以及
[0035] (b)检测是否存在免疫效应分子或其水平的升高。
[0036] 存在(或不存在)免疫效应分子或其水平的升高表示该对象的细胞介导的免疫应 答水平或能力。具体而言,所述方法允许测定所述对象之前是否接触过抗原或者测试的抗 原所代表的抗原。由此,可以测定该对象是否能够引发针对所述抗原的细胞介导的免疫应 答。在某些实施方式中,还可测定细胞介导的免疫应答的定量水平。在某些实施方式中,本 文公开的试验中检测的细胞介导的免疫应答的量级可能与疾病状态、进展和/或严重性相 关。因此,本发明提供了测定对象中细胞介导的免疫应答的方法。所述方法能够进行和/ 或支持(但不限于)疾病诊断,特别是感染性疾病、病理状况,允许测定免疫活性水平并允 许评价对内源或异源试剂以及蛋白毒剂的免疫细胞应答。该试验还能筛选或监测先前暴露 于特定抗原(例如与疾病、感染或污染物相关联的抗原)的对象。下文将描述所述方法的 其他重要应用和用途。
[0037] 现在将详细解释本发明的第一方面所述方法的单个方法步骤和优选实施方式。
[0038] 步骤(a)
[0039] 在步骤(a)中,使包含免疫细胞的样品接触至少一种抗原和至少一种非还原糖, 所述免疫细胞能够在由抗原进行刺激后产生免疫效应分子。该免疫细胞和/或整个样品可 获自例如其细胞介导的免疫应答待测定的对象。
[0040] 提及"对象",包括例如人类或非人物种,包括灵长类、家畜动物(如绵羊、牛、猪、 马、驴、山羊)、实验室试验动物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、仓鼠)、伴侣动物(如狗、猫)、 鸟类物种(如家禽鸟、飞鸟)、爬行动物和两栖动物。本文公开的方法在研究、人类医学以及 畜牧、兽医和野生应用中具有实用性。优选地,该对象是人且本文所述的细胞介导的免疫应 答方法用于筛选对致病微生物、病毒和寄生虫的应答力、疾病病症、疾病发展潜力,或者监 控自免疫情况、监控对象对肿瘤攻击或免疫治疗的应答、监控针对疾病的细胞介导的免疫 应答和用于测定是否存在任何免疫缺陷或免疫抑制。后者可由例如包括各种化疗试剂的某 些药物引起。或者,可以使用本发明所述方法测定对环境蛋白毒剂和污染物的暴露。
[0041] 该样品包含能够在使用适当抗原刺激后产生免疫效应分子的免疫细胞。"免疫细 胞"包括但不限于淋巴细胞(包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细 胞)、树突细胞或者能够在对直接或间接抗原刺激的应答中产生一种或多种免疫效应分子 的任何其他免疫细胞。优选地,该样品包含淋巴细胞,更优选地包含T淋巴细胞。术语"T 细胞"和"T淋巴细胞"在本文中可互换使用。T细胞能够引发强免疫应答,前提是其识别提 供的抗原。如果T细胞之前已接触测试的抗原或测试的抗原所代表的抗原,则出现具有该 抗原特定记忆的T细胞的迅速再刺激。这些抗原特异性T细胞通过分泌免疫效应分子(例 如,特别是干扰素 γ)来进行应答。随后,可以针对测试的抗原的免疫应答的特异性标记物 的形式测量干扰素 γ或针对释放的干扰素 γ产生应答而释放的免疫效应分子。因此,根 据一个实施方式,该样品包含T淋巴细胞,优选CD4+辅助T细胞和/或CD8 +细胞毒性T细 胞。优选地,该样品还包含相应刺激器细胞,特别是能够将测试的抗原呈递至T细胞的抗原 呈递细胞。然而,还可单独地向孵育组合物中添加合适的抗原呈递细胞。分别添加的抗原 呈递细胞(APC)包括天然以及人工的抗原呈递细胞或颗粒。例如,刺激器细胞(如经辐射 的自体或HLA匹配的抗原呈递细胞)可任选地单独添加至孵育组合物中,所述孵育组合物 随后将抗原呈递至T细胞。该实施方式是例如可行的,前提是该样品不包含诱导T细胞应 答所必需的各刺激器细胞。人工抗原呈递实施方式包括但不限于与重组MHC分子或肽和重 组共刺激分子相关的颗粒或脂质囊泡。
[0042] 优选地,该样品可获自对象。根据一个实施方式,该样品是包含免疫细胞的体液或 者是含有来源于各体液的部分的免疫细胞。根据优选的实施方式,该样品是全血。"全血" 指基本未稀释或分级的来自对象的血液。根据一个实施方式,该全血样品是外周血。然而, 对于测定细胞介导的免疫应答活性而言,全血是优选的和最方便的样品,也可使用其他含 有免疫细胞的样品。示例包括但不限于淋巴液、脑脊液、组织液(如骨髓或胸腺液)和呼吸 液(包括鼻液和肺液和支气管肺泡灌洗液)。上述样品的部分或衍生物(如消耗了非测量 细胞介导的免疫应答所必需的细胞的样品)也可用作样品并可通过样品处理获得。例如, 可通过本领域已知的方法处理全血以去除非CMI应答所必需的组分(如血红细胞和/或血 小板)或可处理全血以富集白细胞。还可通过本领域已知的方法获得暗黄层细胞或外周血 单核细胞(PBMC)并可将其用作样品。根据一个实施方式,将培养的免疫细胞用作样品。此 外,低温保存的细胞(如低温保存的PBMC细胞)也可用作对象的免疫细胞来源并因此用作 样品。例如,可使融化的PBMC细胞接触培养基以提供含有免疫细胞的样品,随后使其接触 优选以单个组合物形式添加的抗原和非还原糖并与其孵育。根据一个实施方式,该样品包 含介导细胞免疫应答所必需的所有免疫细胞。然而,如上文所述,单独添加刺激器细胞(特 别是抗原呈递细胞)也包括在本发明的范围内。根据一个实施方式,该样品包含至少T细 胞(T淋巴细胞)和NK细胞(NK淋巴细胞)。根据一个实施方式,在使样品接触抗原和/或 非还原糖前,对样品的稀释不超过50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或3%。 [0043] 使待分析的样品接触至少一种抗原和至少一种非还原糖以提供孵育组合物。
[0044] 本文所用术语"抗原"具体指能够刺激或再刺激免疫应答(且特别是能够刺激或 再刺激细胞免疫应答)的任何分子或试剂。因此,可以在广义上使用术语"抗原"。该术语 具体指可由主要组织相容性复合物(MHC)结合并可被呈递至T细胞受体或被抗体结合的任 何分子或试剂。该术语还指可被非经典MHC蛋白(如CDld或其他CDl家族成员)结合的 任何分子或试剂。根据一个实施方式,该抗原是免疫原。根据一个实施方式,该抗原不是免 疫原。抗原包括但不限于肽、蛋白、半抗原、变应原或毒素或任何天然产生或合成的分子或 其部分。根据一个实施方式,该抗原是无活性病原体或其部分或裂解物。根据一个实施方 式,该抗原选自肽、蛋白(包括糖蛋白)、碳水化合物、磷脂、磷蛋白、磷脂蛋白和前述物质的 片段。除非上下文明确有不同的说明,本文所用术语"肽"还包括多肽和蛋白。术语"蛋白" 还包括修饰的形式,如糖蛋白和磷蛋白。根据一个实施方式,该抗原包括一种或多种全长或 部分长度的肽。根据一个实施方式,该抗原由肽提供。根据一个实施方式,用作抗原的一种 或多种肽的长度选自5-100个氨基酸,优选7-50个氨基酸。根据一个实施方式,该抗原由 来自一种或多种不同的全长或部分长度的肽组提供。肽组包含至少两种肽且在一个实施方 式中包括一系列重叠或非重叠的肽。各肽组可覆盖天然产生的蛋白抗原的整个长度或一部 分。然而,该肽不必需是重叠的或者可通过单个氨基酸或多个氨基酸来重叠。根据一个实 施方式,使用了一种肽组,其包括天然产生的肽或蛋白抗原的80-100%。
[0045] 根据一个实施方式,该抗原由至少一种被⑶8+细胞毒性T细胞识别的肽提供。对 于该实施方式,该抗原优选由至少一种长度小于15个氨基酸(优选13个氨基酸或更少、12 个氨基酸或更少、11个氨基酸或更少或者10个氨基酸或更少)的肽提供。被CD8+细胞毒性 T细胞识别的各种肽的合适的大小范围包括7-14个氨基酸残基、7-13个氨基酸残基、8-12 个氨基酸残基、8-11个氨基酸残基和8-10个氨基酸残基。还可使用包含被CDS+细胞毒性 T细胞识别的肽或由其组成的肽组。所述肽可包括全部或一部分蛋白抗原(如天然产生的 蛋白抗原)。发现包含各短肽作为抗原的试验显示在单糖(如葡萄糖或右旋糖)存在的情 况下储存期间试验活性的显著降低。使用非还原糖时未观察到该现象,如同本发明教导的 那样。本文中,由于纳入了非还原糖,试验灵敏度维持增加,即使在延长的试验组分储存时 间后也是如此。在使用包含被CDS+细胞毒性T细胞识别的肽抗原和非还原糖(例如分别 作为试剂盒化合物组分)的组合物时,这是重要的
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