一种小分子标记探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物的检测和成像领域，具体的说是一种小分子标记探针及其应 用。
【背景技术】
[0002] 在环境安全检测和人体健康的监控中，许多生物靶点分子的含量非常低。很多 生物信号分子、有害微生物或肿瘤细胞在初期浓度非常低，需要对靶点物质进行信号放大 才可以检测分析。目前，研究者们已经发现了集中几种信号放大的技术来检测低丰度靶 点，包括银增加强反应、酪氨酸信号放大、酶金属矿化和滚环放大报告系统。银增强反应 基于纳米金催化沉淀银，从而来检测核酸、蛋白质和微生物等有害物质（Wan, Y.，Wang, Y.， ffu, J. , Zhang, D. , 2011b. Analytical Chemistry 83 (3), 648-653 ；Taton, T. A. , Mirkin, C. A. , Letsinger, R. L. , 2000. Science 289 (5485), 1757-1760.)。相对银增强的技术来说，替 代的方案用过氧化物酶来催化银的沉淀，这种方法叫酶矿化技术（MBller，R.，Powell，R. D.，Hainfeld，J.F.，Fritzsche，W·，2005. Nano Letters 5(7)，1475-1482)。最近出现一 种超灵敏的技术，结合氢化酶标记的酶联免疫反应来控制纳米金生成过程，产生肉眼可 见的信号（de la Rica, R·，Stevens, M.M·，2012. Nature Nanotechnology doi :10.1038/ nnano. 2012. 186)，来分析生物靶点物质。酪氨酸信号放大系统结合生物沉淀和荧光标记 来增强标准免疫反应的灵敏度（Clutter, M. R.，Heffner, G. C.，Krutzik, P. 0·，Sachen, K. L.，Nolan, G. Ρ·，2010. Cytometry Part A 77A (11)，1020-1031)。滚环放大技术是一种恒 温核酸扩增方法，在RCA反应中，DNA目标链可沿环形探针顶替扩增，实现高灵敏度的检测； 同时环形探针的链接成环对DNA单碱基错配有很高的特异性，适合单核苷酸突变的分析检 测 。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种小分子标记探针及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0005] -种小分子标记探针，荧光探针的识别单元为糖类活性功能的小分子标记。
[0006] 所述具有糖类活性功能的小分子标记为棉籽糖、水苏糖、海藻糖或花蕊糖。
[0007] 将所述小分子标记与量子点、磁性颗粒、荧光素或纳米金交联即得探针。
[0008] 所述量子点为核壳结构量子点（CdSe-Au核壳结构）、稀土元素掺杂的量子点或羧 基修饰的量子点。
[0009] 所述荧光素为罗丹明类、细胞色素 c类、AlexaFluor系列染料或异氰酸荧光素类。
[0010] 磁性颗粒为通过磁性弛豫信号来检测磁场的信号，而非利用磁性纳米颗粒的磁分 离信号所述的信号探针对于微生物检测具有选择性成像、检测功能。微生物的生理活动能 够显著的增强信号，其信号的放大是通过微生物吸收利用糖类小分子探针而累积的。
[0011] -种小分子标记探针的应用，利用所述小分子标记探针使其与微生物细胞特异性 的结合，通过识别小分子标记转运通道进行运转和吸收，进而能够对微生物特异性的分析 和成像。
[0012] 本发明所具有的优点：
[0013] 本发明利用棉籽糖类活性小分子标记的荧光信号系统来快速检测和分析微生物， 比如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、爱德华迟缓菌、费氏弧菌、炭疽杆菌等，用其检测能够控制 微生物浓度和显著的信号放大成像。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用棉籽糖 类信号标记系统来快速检测和分析微生物具有显著的特异性，同时准确性高。利用棉籽糖 类活性功能小分子标记信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不 容易失活，价格便宜等优势。
[0014] 本发明基于棉籽糖的荧光探针对微生物的成像比其他的方法高两个数量级，其方 法检测微生物是通过微生物主动吸收荧光探针的特异性机制，微生物细胞特异性的棉籽糖 转运通道能够快速主动的转运吸收荧光探针。荧光探针能够选择性积累，其浓度能够达到 mmol浓度，是哺乳动物细胞的10倍。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明实施例提供的棉籽糖荧光探针的合成路线图。
[0016] 图2为本发明实施例提供的六种微生物对棉籽糖荧光探针的利用情况比较图，其 中（A)、细菌和细胞的失活情况对于棉籽糖荧光探针的情况对比（B)、大肠功能对于棉籽糖 的吸收动力学情况（C)、葡萄糖和棉籽糖对于棉籽糖荧光探针的竞争结合实验（D)。
[0017] 图3为本发明实施例提供的大肠杆菌和爱德华迟缓细菌不同微生物的检测状态 图。
[0018] 图4(a)和（C)分别为迟缓爱德华菌破碎前后的照片；(b)和（d)分别为大肠杆菌 破碎前后的照片。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0020] 实施例1 :
[0021] 棉籽糖荧光聚合物：
[0022] 2, 7-二溴荷（2. 7-dibromofluorene I. 62g)、氨基丙基溴 (tert-butyl-3-bromop;ropanoate 2.30g)、Na0H(40 %，12mL)、Bu4NBr(0.16g)和甲苯 (25mL)于85°C反应12h。分液萃取保留有机相，用水清洗，并用无水MgSO 4干燥，旋转蒸发 有机溶剂，固体物质用硅胶柱色谱纯化（CH2C12)。
[0023] 2,7-二溴-9,9-二甲基芴，单体厶(0.41111，0.2328) ;4,7-二溴-[1，2,5]噻二唑并 [3,4-(：]吡啶，单体8(0.61111，0.1768);9,9-二辛基芴-2,7-二硼酸二（1，3-丙二醇）酯，单 体〇（11111，0.568)分别溶解在201^甲苯，然后再加入811 4他412.511^)和似2〇)3(21，121^)， 溶液体系脱气/氩气连续四次，加入Pd (PPh3) 4 (40mg)，溶液体系脱气/氩气连续四次，反应 物于90度搅拌40h，再加入苯硼酸（IOOmg溶于Iml THF)反应2h，再加入1ml溴苯反应3h， 再加入100mL甲醇沉淀有机物，然后用甲醇、水和丙酮清洗。粗产物溶于15mL CH2C12,用 0. 2微米微孔滤膜过滤，然后用IOOmL甲醇沉淀，再在IOOmL丙酮中搅拌2小时，过滤，真空 中干燥，得到荧光聚合物。
[0024] 上述制备得到的聚合物（IOOmg)溶解在20mL CH2C12，再加入I. 5ml三氟乙酸，避 光反应12h，用10% NaOH(30ml)清洗三次，再用小量醋酸酸化，萃取分液保留有机相，用水 清洗有机相并分离，旋转蒸发浓缩到5mL，加入50ml甲醇沉淀，过滤用丙酮清洗。用超声沉 淀法制备聚合物量子点：〇. 2ml固体聚合物溶解在四氢呋喃中PFBT (lmg mL-1)注射到IOml 水中，超声处理l〇min，在氩气条件下，加热到90°C挥发四氢呋喃。用0. 2 μπι的滤膜过滤。 即可得到聚合物量子点。
[0025] 再用EDC交联剂制备抗生素功能化的半导体量子点：具体的说，0.1 ml聚乙二醇 (5% )、0· Iml HEPES缓冲液（lmol L-1)加入到5ml的Pdots中。再加入0· 5ml氨基化的棉 籽糖（5mg mL-1)，反应体系搅拌混匀。再加入0.1 ml新鲜配置的EDC (5mg mL-1)，反应2h， 用透析膜透析24小时，获得棉籽糖铰链的荧光聚合物。
[0026] 大肠杆菌对于棉籽糖荧光聚合物的吸收利用情况
[0027] 大肠杆菌菌斑重悬浮到30ml的PBS缓冲液中，紫外分光光度计（波长为600nm) 测量其OD值为0. 5。而后将大肠杆菌悬浮液转移到IOml离心管中，每个离心管加入5ml