一种同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测农药残留的电化学免疫传感器及其制备方法与应用，具体涉 及一种同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 三唑锡又称倍而霸、灭螨锡、亚环锡等，化学名称为1 -(三环己基甲锡烷 基）-1-氢-1，2, 4-三氮杂茂，分子式为C20H35N3Sn，CAS号为41083-11-8,为触杀作用较 强的广谱性杀螨剂，可杀灭若螨、成螨和夏卵，残效期较长。我国国家标准GB16333-1996规 定三唑锡在水果中的最高残留限量为2. Omg/kg，而国际食品法典委员会（CAC)规定三唑锡 的最尚残留限量为〇. lmg/kg，法国规定二唑锡的最尚残留限量为0. 20mg/kg。
[0003] 毒死蜱[chlorpyrifos，0，0-二乙基-0-(3, 5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸 酯]是一种世界范围内广泛应用的高效杀虫剂，可用在粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫 防治，但环境样品中发现发现毒死蜱残留的情况日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威 胁。因此，随着人们对毒死蜱残留的毒性与环境风险的日益关注，亟需更科学、快捷和高效 的检测手段。
[0004] 目前，农药残留检测方法主要有仪器检测法、免疫检测法等。其中，仪器检测法主 要包括气相色谱法、液相色谱法、质谱法、气质联用法及液质联用法等，但通常需要对样品 进行繁琐复杂的预处理，耗时费力，成本高，而且所用仪器比较昂贵，一次性投入较大，需要 专业技术人员维护，不适于现场检测。酶联免疫吸附测定法（ELISA)现在已成为目前分析 化学领域中的前沿技术，可以开发出许多快速检测产品，例如快速检测试剂盒、快速检测试 纸条，免疫传感器等；而试剂盒或试纸条产品一般是针对一个药物，即单残留的检测，在实 际生产中由于农药的复配使用非常普遍，农产品中残留的农药往往有多种，单农药组分免 疫分析方法难以满足实际检测的需要。但对于不同类的多种抗体就很难在一个试剂盒或试 纸条上实现同时检测，一种简单且有效的改进措施就是使用生物传感器。
[0005] 目前，商品化的农药传感器主要基于固定化乙酰胆碱酯酶生物传感器（AChE)的 电流型酶电极生物传感器的抑制作用来检测农药，但AchE电流型生物传感器的最大缺点 是酶催化产物硫代胆碱的氧化反应需要较高的电位，会大大降低传感器的稳定性；同时使 用媒介质，由于酶抑制作用的生物传感器的选择性差，为了提高生物传感器的选择性，人们 研制了以抗体作为识别受体的免疫传感器，同时将纳米材料引入分析化学研究中，成为一 个研究热点，已取得许多创新性研究成果。近年来，免疫传感器作为一种新兴的生物传感器 以其鉴定物质的高度特异性、敏感性和稳定性，在国民经济中的临床诊断、工业控制、食品 和药物分析、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应用前景。目前，国内 尚无同时检测农药三唑锡和毒死蜱的快速检测试剂盒和免疫传感器等快速检测的产品。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种同时检测农药三唑锡和毒死蜱的电化学 免疫传感器及其制备方法。
[0007] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
[0008] 本发明之一种同时检测三唑锡和毒死蜱的电化学免疫传感器，包括两个工作电 极、两个参比电极、两个辅助电极，其中一个工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳 米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活 性位点；另一个工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合 膜，毒死蜱人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。
[0009] 进一步，所述基底电极为ITO玻璃电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助 电极为铂电极；所述三唑锡人工抗原是以三环锡和5-巯基-3-氨基-1，2, 4-三氮唑为初始 原料先合成三唑锡半抗原，再与牛血清蛋白偶联制备而成的三唑锡人工免疫抗原，所述毒 死蜱人工抗原是毒死蜱人工免疫抗原或包被抗原。
[0010] 本发明之一种电化学免疫传感器的制备方法，首先在预处理的两个基底电极表面 分别滴加萘酚溶液，烘干；接着分别滴加纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再分别 滴加戊二醛溶液活化，清洗，氮气吹干；然后其中一个基底电极滴加三唑锡人工抗原，另一 个基底电极滴加毒死蜱人工抗原，分别孵育，过夜，清洗，烘干，最后分别滴加牛血清蛋白 缓冲液封闭。
[0011] 进一步，所述免疫传感器包括以下步骤：
[0012] (l)nan〇-C〇304/PAN复合材料的制备：将0· 3~0· 4g十六烷基三甲基溴化铵溶解 在45~55mL蒸馏水中，加入0. 2~0. 4g的Co3O4纳米颗粒，超声分散、搅拌4. 5~5. 5h 后加入150~200 μ L苯胺，持续搅拌0. 5~I. 5h，加入相当于苯胺物质的量1. 5倍的柠檬 酸，搅拌9. 5~10. 5h，加入与苯胺物质的量等量的硫酸铵，继续搅拌11. 5~12. 5h后停止 反应，将反应后的产物进行抽滤，保留滤饼，依次用去离子水和无水乙醇多次洗涤至滤液无 色，将滤饼置于真空烘箱中60°C干燥4小时即得nan〇-C 〇304/PAN复合材料，备用；
[0013] (2)三唑锡人工抗原的合成：称取193g~195g的三环锡用24~26mL甲醇将其 溶解，然后缓慢的滴加到58g~59g用48~52mL 80°C~85°C热水溶解的5-巯基-3-氨 基-1，2, 4-三氮唑，搅拌1~2h后有大量白色沉淀生成，将白色沉淀过滤后用开水洗涤3~ 4遍，干燥后用95%乙醇进行重结晶，即得三唑锡半抗原ACT-Hl ;将8mg~IOmg三唑锡半抗 原用2. 5mL~3. 5mL DMF溶解，祸旋震荡下缓慢的加入9mL~IlmL蒸馏水，然后加入38mg~ 42mg BSA，待完全溶解后，滴加30~50 μ L戊二醛溶液，4°C下搅拌过夜，溶液由乳白色变为 微黄色；4°C下用生理盐水溶液透析45h~48h，每3~4h换一次水；即得到三唑锡免疫抗原 ACT-H1-BSA，用生理盐水稀释至lmg/mL~I. 5mg/mL，-20°C保存；在农药残留的免疫化学分 析中，人工抗原的合成是制备抗体和建立免疫分析方法最关键的步骤，半抗原的设计又是 合成人工抗原的前提；半抗原的设计应考虑两方面的因素：第一，能否刺激机体产生免疫 应答；第二，产生的抗体能否具有预期的活性；另外，还应注意以下问题：半抗原结构中是 否含有芳香结构；据文献统计，如果结构中有芳香结构，其平均成功率约为1/3,相比之下， 不含芳香结构的半抗原，成功率仅占1/11，其原因是前者形成的抗原具有较强的免疫原性， 可使机体产生较强的免疫应答，因而增加了筛选概率；由于三唑锡分子中中间含有锡，周围 的位阻很大，几乎不能连接手臂，更不能与BSA连接，本发明独创性地选择另外的物质三环 锡作为反应物，通过化学反应，来合成三唑锡并引入手臂。
[0014] (3)基底电极的预处理：将基底电极切成4X lcm，乙醇超声清洗，烘干，用绝缘胶 将探头面积封至Icm2，再依次用洗洁精、丙酮、乙醇、去离子水中各超声清洗5~lOmin，氮 气吹干，备用；
[0015] (4)基底电极的表面修饰：首先在步骤（3)备用的一个基底电极表面滴加50~ 60 yL 0. 75%萘酚溶液，烘干；接着滴加100~120 yL 1:400稀释的步骤（1)中备用的纳 米钴-四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再接着滴加100~120 y L 0. 25 %戊二醛溶液， 常温下活化2~3h后，用水冲洗干净并用氮气吹干，然后滴加100~120 μ L 1:1600稀释 的三唑锡人工抗原，于37°C下孵育3~4h，过夜，用0.0 lmol/L，ρΗ7. 2~7. 6的PBS缓冲液 冲洗干净，烘干；另一个基底电极滴加50~60 μ LI. 25%萘酚溶液，烘干；接着滴加100~ 120yL 1:800稀释的步骤（1)中备用的纳米钴-四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再 接着滴加100~120 μ L 0. 25%戊二醛溶液，常温下活化2~3h后，用水冲洗干净并用氮气 吹干，然后滴加100~120 μ L 1:1600稀释的毒死蜱人工抗原，分别于37°C下孵育3~4h， 过夜，用〇· 〇lmol/L，ρΗ7· 2~7. 6的PBS缓冲液冲洗干净，烘干；
[0016] (5)非特异性活性位点的封闭：将表面修饰后的基底电极分别滴加100~120 μ L 5mg/mL牛血清蛋白缓冲液放于37°C恒温封闭5~6h，取出用0· 01mol/L，ρΗ7· 2~7. 6的 PBS缓冲液冲洗干净，即得电化学免疫传感器。
[0017] 本发明之一种利用电化学免疫传感器同时检测三唑锡和毒死蜱的方法，包括以下 步骤：（1)修饰工作电极：先将所述电化学免疫传感器的一个工作电极滴加三唑锡单克隆 抗体溶液和三唑锡标准品组成的混合液；另一个工作电极滴加毒死蜱单克隆抗体溶液和毒 死蜱标准品组成的混合液，分别放于37°C下孵育50~70min，取出用0. 008~0. 012mol. L 1PH 7. 2~7. 6的PBS缓冲液反复冲洗干净，随后分别滴加纳米铜棒标记的IgG-HRP抗体 和纳米银标记的IgG-HRP抗体，37°C下孵育30~45min，取出用0. 008~0. 012mol. L 1PH 7. 2~7. 6的PBS缓冲液反复冲洗干净，备用；
[0018] ⑵建立工作曲线：将步骤⑴中修饰后的两个工作电极与两个参比电极、两个辅 助电极分别插入体积比为I : 1 : 1，物质的量之比满足0.1 : 5 : 5的氯化钾、亚铁氰化 钾和铁氰化钾混合成PH 7. 4缓冲液中组装成相应的两组三电极系统，然后组装在一个检 测器，在不断搅拌下加入相当于三唑锡单克隆抗体溶液和三唑锡标准品组成的混合液或毒 死蜱单克隆抗体溶液和毒死蜱标准品组成的混合液体积的0. 1倍的0. 4mol/L~0. 5mol/L 的双氧水，采用循环伏安法通过单刀双掷开关来测定不同浓度三唑锡标准品和毒死蜱标准 品的电流值，三唑锡标准品和毒死蜱标准品浓度与相应的电流值之间的函数关系，即为电 化学免疫传感器工作曲线；
[0019] (3)测定三唑锡和毒死蜱：利用步骤⑴修饰后的两工作电极在-0. 8~0. 8V的范 围内进行循环伏安扫描，分别测定三唑锡和毒死蜱待测溶液中的电流值，然后根据步骤（2) 获得的工作曲线，即可计算出待测溶液中三唑锡和毒死蜱的浓度