作为用于重量增加预防的益生元功效的生物标记物的三甲胺的制作方法
【专利说明】作为用于重量增加预防的益生元功效的生物标记物的三甲 胺 发明领域
[0001] 本发明一般涉及营养和健康的领域。特别地，本发明涉及用于预测和/或量化受 试者对益生元在预防膳食诱导的重量增加中的响应的方法、以及可用于此类方法的生物标 记物。
[0002] 发明背景
[0003] 肥胖症是主要的公共健康问题，因为其增强罹患日益流行的数种慢性疾病的风 险。肥胖症起因于能量摄取和消耗之间的不平衡，与慢性低级炎症相关。已知有助于发展 2型糖尿病（T2DM)、非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)、癌症、骨关节炎和心血管疾病（CVD)的 风险。肥胖症起因于遗传因素和环境因素如高热量膳食和缺少身体活动之间的复杂相互作 用，最近的研究也已表明肠道微生物群可在发展肥胖症中起作用。失衡的富含脂肪和/或 碳水化合物的膳食与脂肪组织、肌肉、肝脏和心脏中的三甘油酯贮存相关。异位脂肪沉积、 特别是在中央分布中的异位脂肪沉积也被认为促成一系列代谢病症如高甘油三酯血症、高 血压、高空腹葡萄糖和胰岛素抵抗（IR)。
[0004] 肠道微生物被认为通过影响代谢和免疫宿主功能而有助于体重调控和相关病症。 总的来说，肠道微生物群改善宿主提取和贮存来自膳食的能量、从而导致体重增加的能力， 同时具体的共生微生物似乎对胆汁盐、脂蛋白和胆固醇代谢发挥有益效应。肠道微生物群 和一些益生菌也调控免疫功能，保护宿主免受感染和慢性炎症。相比之下，生态失调和内毒 素血症可以是炎症性因子，其是发展胰岛素抵抗和体重增加的原因。按照肠道微生物群、代 谢和免疫之间的联系，使用膳食策略调控微生物群组成可能在控制代谢病症方面有效。尽 管迄今为止仅一些临床前和临床试验已表明具体的肠道微生物和益生元对这些病症的生 物学标记物的效应，但是这些发现指示这一领域的进展可能在针对肥胖症及其相关代谢病 症的斗争中具有价值（Sanz等人2008)。
[0005] 来自实验模型和人体研究的最近数据支持了具有益生元性质的特定食品对能量 稳态、饱腹感调控和体重增加的有益效应。与肥胖动物和患者中的数据一起，这些研究支持 以下假设：肠道微生物群组成（尤其是双歧杆菌属的数量）可有助于调控与X综合征、尤其 是肥胖症和2型糖尿病相关的代谢过程。这些效应与微生物群-诱导的变化相关是有道理 的，即使不是唯一的，并且得出它们的机制符合益生元效应的结论是可行的。然而，这些健 康益处的此类变化的作用仍有待明确证实。作为在15年前益生元概念公布之后的研究活 动的结果，已变得清楚的是，引起肠道微生物群的组成和/或活性的选择性变化、由此加强 正常生态（normobiosis)的产品，可诱导结肠中以及也在肠外隔室中的有益生理效应，或 有助于减少生态失调以及相关肠和系统性病理学的风险（Roberfroid等人，2010)。
[0006] 因此，希望提供本领域一种允许其早期鉴定增加重量-理想地处于增加重量风 险-的受试者的方法（例如如在启动重量减轻程序后）。特别地，希望提供一种用于预测 和/或量化受试者对益生元在预防膳食诱导的重量增加中的响应的方法，尤其是在开始施 用益生元后的早期阶段。
[0007] 因此，本发明的目的是提供：根据它们是否可能对基于益生元的干预作出反应以 预防高脂肪膳食诱导的或相关的重量增加，而允许对受试者早期分层的方法。
[0008] 发明概沐
[0009] 因此，本发明提供用于预测和/或量化受试者对益生元在预防膳食诱导的重量增 加中的响应的方法，其包括确定获自已食用益生元的受试者的尿样品中的三甲胺的水平， 以及将受试者的三甲胺水平与预定参照值比较，其中与预定参照值比较，尿样品中的三甲 胺水平增加、或三甲胺水平没有变化，指示益生元的施用在预防受试者中膳食诱导的重量 增加中有效。
[0010] 在一个实施方案中，该膳食为高脂肪膳食。
[0011] 在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：
[0012] a)确定尿样品中至少一种选自以下的其他生物标记物的水平：草酰乙 酸（oxaloacetate)、硫酸吲噪酸（indoxylsulfate)、肌酸酐和α -酮-异戊酸 (a -keto-isovalerate)，以及
[0013] b)将受试者的至少一种其他生物标记物的水平与预定参照值比较，
[0014] 其中与预定参照值比较，尿样品中草酰乙酸、硫酸吲哚酚、肌酸酐和/或 α -酮-异戊酸水平减少，或草酰乙酸、硫酸吲哚酚、肌酸酐和/或α -酮-异戊酸水平没有 变化，指示益生元的施用将在预防受试者中膳食诱导的重量增加中有效。
[0015] 在一个实施方案中，尿样品中的生物标记物的水平通过1H-NMR和/或质谱法来确 定。
[0016] 在一个实施方案中，预定参照值是基于食用高脂肪膳食的受试者对照群体中的尿 中平均三甲胺水平。在另一个实施方案中，预定参照值是食用益生元前受试者中的尿中三 甲胺水平。
[0017] 在一个实施方案中，确定获自至少连续三天食用益生元后的受试者尿样品中三甲 胺和/或其他生物标记物的水平。优选受试者已经食用至少2g/天的量的益生元持续该时 间段或更长时间。
[0018] 在一个实施方案中，益生元选自下组：低聚糖，任选地含有果糖、半乳糖、甘露 糖；膳食纤维，特别地可溶性纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。优选益生元选自下 组：低聚果糖（FOS);低聚半乳糖（GOS);低聚异麦芽糖；低聚木糖；牛乳低聚糖（bovine milk oligosaccharides, BM0S);糖基鹿糖（glycosylsucrose)，GS);低聚乳果糖 (lactosucrose，LS);乳果糖（LA);低聚帕拉金糖（palatinose-oligosaccharides，ΡΑ0); 低聚麦芽糖（MOS);树胶和/或其水解物；果胶和/或其水解物；及其组合。
[0019] 在一个优选实施方案中，益生元包含牛乳低聚糖（BMOS)，更优选奶牛乳低聚 糖-半乳低聚糖（CM0S-G0S)。在另一个优选实施方案中，益生元包含菊粉和低聚果糖 (FOS) 〇
[0020] 在一些实施方案中，受试者为哺乳动物如人；非人物种，包括灵长类动物；家畜动 物如绵羊、奶牛、猪、马、驴或山羊；实验室试验动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、或仓鼠；或陪伴 动物如狗或猫。
[0021 ] 在一个实施方案中，该方法用于设计用于一组受试者的分层膳食或用于受试者的 个性化膳食。
[0022] 另一方面，本发明提供一种用于预防受试者中膳食诱导的重量增加的方法，其包 括：
[0023] a)执行如上所述的方法；以及
[0024] b)如果尿样品中三甲胺的水平相较于预定参照值增加或未改变，则向受试者施用 益生元。
[0025] 在一个实施方案中，益生元向受试者的施用持续至少一个月。
[0026] 在一个实施方案中，如果尿样品中三甲胺的水平相较于预定参照样品减少，则不 向受试者施用益生元。优选向受试者提供用于重量增加预防的替代治疗，所述治疗选自热 量限制、膳食脂肪摄取减少、非益生元重量减轻产品、或锻炼方案。
[0027] 另一方面，本发明提供用于预测和/或量化受试者对益生元在预防膳食诱导的重 量增加中的响应的尿中生物标记物，其中生物标记物为三甲胺。
[0028] 另一方面，本发明提供三甲胺作为尿中生物标记物用于预测和/或量化受试者对 益生元在预防膳食诱导的重量增加中的响应的用途。
[0029] 附图简沐
[0030] 图1 :描述动物的体重曲线。
[0031] 图2 :具有对益生元的具体响应且涉及重量增加的代谢物的依时性曲线。A :对照； B :高脂肪对照，C :高脂肪GOS ;D :高脂肪G0SCM0S，E :高脂肪Prebiol，F :高脂肪糖。垂直 轴对应于由峰面积积分获得的代谢物中的相对浓度，数据以曲线下面积（AUC)给出。
[0032] 图3 :具有对益生元的具体响应且涉及重量增加的代谢物的依时性曲线。TMA，三 甲胺；ΤΜΑ0,三甲胺-N-氧化物。A :对照；B :高脂肪对照，C :高脂肪GOS ;D :高脂肪G0SCM0S， E :高脂肪Prebiol，F :高脂肪糖。垂直轴对应于由峰面积积分获得的代谢物中的相对浓度， 数据以曲线下面积（AUC)给出。
[0033] 发明详沐
[0034] 本发明人已使用代谢组学（metabonomics)方法来实现本发明的目的。代谢组学 用于表征代谢表型，其包含各种因素如环境、药物、膳食、生活方式、遗传学和微生物组学因 素的影响。与指示潜在生理变化的基因表达和蛋白质组数据不同，代谢物及其在细胞、组织 和器官内的动态浓度变化表示生理调控过程的实际终点。
[0035] 因此，研究与各种膳食干预和疾病发展相关的逐步代谢变化是适合的方法。近来， 基于代谢物组学（metabolomics)和脂类组学的发现已加速我们对疾病过程的理解，将提 供用于预防和营养管理与代谢综合征相关的亚临床病症的新途径。特别地，"组学"数据已 突出能量代谢（Krebs循环）、脂质和氨基酸加工、以及炎症信号对肥胖症和IR发作的贡献。
[0036] 使用随时间推移而收集的尿样品的质子核磁共振（1H NMR)光谱学和重量增加监 测的组合，发明人已经在明确定义的C57BL/6小鼠膳食诱导的肥胖症模型中鉴定了指示用 于重量增加预防的益生元干预的功效的新代谢生物标记物。本发明人使用等热量膳食已经 表征了用含和不含益生元的高脂肪膳食（HFD)喂养的C57BL/6小鼠的逐步（例如每周，持 续13周）代谢适应。发明人已经建立了与在不同营养条件下逐步肥胖症发展相关的具体 代谢签名（metabolic signature)，和在体重增加动力学内的表型变异性。
[0037] 通过使用代谢组学方法，发明人已经显示线粒体代谢途径（脂肪酸β氧化、支链 氨基酸分解代谢、丁酸酯代谢、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径和Krebs循环）通过高脂肪喂养 被快速上调，可能反映线粒体的脂肪酸饱和以及能量代谢的损伤。此外，代谢组学分析显示 肠道微生物代谢的显著性重塑，如通过甲基胺、膳食碳水化合物和蛋白质发酵的变化所观 察到的。
[0038] 发明人可显示，在接受基于益生元的干预的该组动物中的体重增加被阻止，并且 与体重表型的差异相关的代谢签名与高脂肪诱导的肥胖症依赖性生物学过程、包括线粒体 氧化途径（脂肪酸β氧化）和肠道细菌代谢（甲基胺、膳食碳水化合物和蛋白质发酵）） 的具体调节相关。
[0039] 特别地，在本文所述的实验中，用HFD喂养的小鼠显示尿中三甲胺随着时间推移 而减少。三甲胺的减少与最终体重增加强关联。当用HFD和益生元（CM0S-G0S和菊粉/F0S) 喂养时，三甲胺的减少被显著地阻止或减弱，而三甲胺仍与最终体重增加强关联。
[0040] 这些结果强调了线粒体和肠道微生物群在肥胖症发展中的作用并且显示：有益地 响应于益生元在预防膳食诱导的重量增加中的可能性，可使用本文所定义的一组特定的生 物标记物由早期代谢签名确定。
[0041] 发明人能够证实：在具有任何益生元的高脂肪喂养一周后（第7天）的尿代谢响 应，使得能够预测每一个体的最终体重增加（第70天）。本方法因此可以预测和/或量化 动物对启动益生元施用后在初期阶段的膳食干预的响应。
[0042] 预测和/或量化受试者对益牛元的响应
[0043] 一方面，本发明涉及预测和/或量化受试者对益生元在预防受试者中膳食诱导的 重量增加中的响应。
[0044] 例如，在一个实施方案中，该方法可用于预测未来或进行中的益生元的施用是否 可能在预防重量增加方面有效。该方法因此可用于例如提供是否继续用益生元治疗以预防 重量增加，或是否将受试者切换至替代治疗方案的指示。
[0045] 在替代实施方案中，该方法可用于确定或量化受试者先前食用益生元的