一种牛奶产品中头孢类药物残留的多联检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物源性食品中药物残留的检测技术领域，是一种用高效液相色谱仪 测定牛奶产品中头抱类药物残留量的方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国畜牧业的快速发展，兽药在降低畜禽发病率和致死率、促进动物生产、改 善动物肉制品品质和提高饲料利用率方面起到了显著的作用，已成为现代畜牧业的重要支 撑。头抱菌素类（Cephalosporins)属于P-内酷胺类抗生素，具有耐青霉素酶、疗效高、毒 性低、过敏反应少、抗菌谱广等特点，可有效抑制细菌的生长和繁殖。在畜牧动物养殖中，头 抱类抗生素广泛用于奶牛乳房炎的预防与治疗，动物尿道、胃肠道及呼吸道等的细菌病的 治疗和防治。但是在实际养殖过程中，由于使用方法的不规范，不但造成动物源细菌病原的 耐药性上升，引发超剂量用药的恶性循环，而且导致畜产品中的药物残留量的积累，引起食 品安全隐患，给人类带来过敏、肠道菌群失调、耐药性上升等严重危害。因此，中国农业部明 确规定（农业部560号公告）头抱赃酬等人医临床控制使用的最新抗菌药物用于食品动 物，会产生耐药性问题，影响动物疫病控制、食品安全和人类健康，予W注销产品批准文号， 不得再生产、经营和使用。"目前对头抱类兽药残留的检测方法多为针对单个药物的检测， 不适应对目前多种头抱类兽药进行监控，因此，建立一种准确、稳定的多联检测方法对于实 现该类药物的有效监控具有重要意义。
[0003] 中国专利（CN200910085945. 7)公开了一种检测头抱类药物的酶联免疫试剂盒及 其应用，通过酶联免疫法对头抱类兽药残留进行检测，只能通过吸光值粗略判断残留量，抗 体制备步骤繁琐，检出限高，不易用作精确定量检测。
【发明内容】
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供一种定量检测牛奶产品中头抱类抗生素残留的 多联检测方法，满足对畜牧临床领域禁用的头抱类抗生素的多联检测需求。本发明对头 抱赃酬、头抱嚷朽、头抱曲松、头抱嚷吩等4种头抱类药物的检出限为分别为0. 26mg/kg、 0. 01mg/Kg、0. 10mg/kg、0. 07mg/Kg;在Img/kg~50mg/kg添加浓度范围内线性关系良好，回 收率为90%~105% ;本方法的批内相对标准偏差《15%，批间相对标准偏差《20%。
[0005] 本发明的技术方案是一种检测牛奶中头抱类抗生素的多联检测方法，包括样品预 提取、标准曲线绘制、仪器检测分析步骤，所述检测方法为使用高效液相色谱进行的一种多 联检测方法，同时检测的药物包括头抱赃酬、头抱嚷目亏、头抱曲松、头抱嚷吩，具体包括如下 步骤：
[0006] (1)样品预提取：称取牛奶样品置于离屯、管中，加入蛋白清除剂，超声波处理后离 屯、，吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入与样品等体积的甲醇-0. 1 %甲酸溶液复溶，加入 脂肪清除剂去除脂肪，振荡，离屯、，弃去正己烧后液体经有机滤膜过滤后转移至栋色瓶中， 备用；
[0007] 优选为称取牛奶样品置于离屯、管中，加入乙腊，超声波处理，500化pm离屯、lOmin， 吸取上清液至试管中，氮气吹干，加入与样品等体积甲醇-0. 1 %甲酸溶液复溶，加入正己烧 去除脂肪，振荡，500化pm离屯、lOmin，弃去正己烧，经有机滤膜过滤后转移至栋色瓶中，备 用；
[000引 似标准溶液配制及标准曲线的绘制：取标准工作液，用甲醇-0. 1 %甲酸溶液进 行不同倍数稀释，绘制标准曲线；
[0009] 优选为分别准确称取头抱赃酬、头抱嚷朽、头抱曲松、头抱嚷吩标准品各lOOmg，用 甲醇-0. 1%甲酸溶解并定容到4个lOmL栋色容量瓶中配制成单标准品溶液，再分别吸取适 量单标准品溶液转移至1个lOmL栋色容量瓶中精确定容，配制成浓度为Img/血的混合标 准品储备溶液。再用甲醇-0. 1 %甲酸溶液将混合标准品溶液经适当稀释，配制成浓度分别 为 0. 001mg/mL、0. 005mg/mL、0. 010mg/mL、0. 020mg/mL、0. 050mg/mL的混合标准品工作液， 采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程；
[0010] 做将步骤（1)所得样品进高效液相色谱仪器检测，将检测结果与所述标准曲线 对比得到待测物浓度。
[0011] 优选条件为采用Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent(C18,4. 6X250， 5ym)Z0RBAXEclipsePlus反相色谱柱；流动相为A-甲醇，B-0. 1%甲酸溶液，A:B(体积 比）=3 : 7~4 : 6;检测波长为254皿;流速为Iml/min;柱溫为35°C;进样量为20iil。
[0012] 进一步的，所述步骤（1)中的超声波处理方法为间歇式，超声波处理5秒，间歇5 秒，60个循环。
[0013] 进一步的，所述步骤（1)中的蛋白清除剂为乙腊，样品液与乙腊的体积比为 1 : 3 ~1 : 4。
[0014] 进一步的，所述步骤（1)中的脂肪清除剂为正己烧，样品液与正己烧的体积比为 2 : 1 ~2. 5 : 1。
[0015] 进一步的，所述甲醇-0.1 %甲酸溶液，甲酸与0.1 %甲酸的体积比为3 : 7~ 4 ： 6。
[0016] 进一步的，所述步骤（1)中的有机滤膜为两步过滤，即先经0.45ym有机滤膜过 滤，滤过液再经0. 22ym有机滤膜过滤。可有效去除样品中干扰物质，缩短处理时间，提高 效率。
[0017] 进一步的，所述样品为液态纯奶产品或者奶粉产品。
[0018] 本发明的检测流程如下：
[001引 （1)样品预处理
[0020] 称取5g牛奶样品，精确至0.Olg，将样品置于离屯、管中，加入15~20血乙腊，超声 波振荡，即超声5秒，间隔5秒，60个循环，500化pm离屯、lOmin，取上清液，吸取上清液至试 管中，氮气吹干，加入甲醇-0.1%甲酸溶液（V/V3 : 7~4 : 6)复溶，加入2~2. 5血正 己烧除脂，振荡，500化pm离屯、lOmin，弃去正己烧，先后经0. 45ym和0. 22ym滤膜过滤后 进高效液相色谱仪分析。
[0021] (2)检测条件设定
[0022]条件为采用Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent(C18,4. 6X250,5ym) ZORBAXEclipsePlus反相色谱柱；流动相为A-甲醇，B-0. 1%甲酸溶液，A:B(体积比） =3 : 7~4 : 6 ;检测波长为254nm;流速为Iml/min;柱溫为35°C;进样量为20y1。
[002引 做标准曲线绘制
[0024] 分别准确称取头抱赃酬、头抱嚷朽、头抱曲松、头抱嚷吩标准品各lOOmg，用甲 醇-0. 1%甲酸溶解并定容到4个lOmL栋色容量瓶中配制成单标准品溶液，再分别吸取适量 单标准品溶液转移至1个lOmL栋色容量瓶中精确定容，配制成浓度为Img/血的混合标准 品储备溶液。再用甲醇-0. 1 %甲酸溶液将混合标准品溶液经适当稀释，配制成浓度分别为 0. 001mg/mL、0. 005mg/mL、0. 010mg/mL、0. 020mg/mL、0. 050mg/mL的混合标准品工作液，义用 高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程。
[0025] (4)将步骤1所得样品经高效液相色谱仪器检测，将检测结果与所述标准曲线对 比得到待测物检测结果。
[002引 妨空白实验
[0027] 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。
[002引 （6)结果测定
[002引①定性测定
[0030] 在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物 的保留时间之比，偏差在±5%W内。
[0031] ②定量测定
[0032] 取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按外标法W峰面积定量。标准溶液 及试样溶液中的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
[0033] ③结果计算和表述
[0034] 按式（a)计算试样中头抱类抗生素的残留量
[0035]式中：
[003引 X-试样中头抱类抗生素的残留量，mg/kg;
[0037] C-试样溶液中头抱类抗生素的浓度，yg/血；
[003引 V-最终样液定容体积，血；
[00測 f-稀释倍数；
[0040]m-试样量，g。
[0041] 注：计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留= 位有效数字。
[0042] ④方法灵敏度、准确度和精密度
[0043] 灵敏度：本方法对头抱赃酬、头抱嚷目亏、头抱曲松、头抱嚷吩等4种头抱类药物的 检出限为分别为0. 26mg/Kg、0. 01mg/Kg、0. 10mg/Kg、0. 07mg/Kg。
[0044] 准确度：本方法对在Img/kg~50mg/kg添加浓度范围内，回收率为90%~105%。 [004引精密度：本方法的批内相对标准偏差《15%，批间相对标准偏差《20%。
[0046] 本发明与现有技术相比的有益效果是：
[0047] 1、本发明采用高效液相色谱法测定牛奶中头抱类抗生素的残留量，流动相使用甲 醇和0.1%甲酸溶液，配比为3 : 7~4 : 6,可W将4种药物完全分开，保证灵敏度，避免 了彼此干扰。
[0048] 2、提取液使用乙腊，可W有效去除蛋白质及部分脂肪类干扰物质；在样品提取过 程中采用正己烧去脂，可W有效去除样品基质中脂肪等干扰物质。
[0049] 3、本发明先后用0. 45ym和0. 22ym滤膜过滤的方式进行上样前处理，可有效去 除样品中干扰物质，缩短处理时间，提高效率。
[0050] 4.本方法填补了目前头抱类检测方法均为针对单一药物的局限性，丰富了多联检 测方法，使其更具有适用性，有利于食品安全的有效监控。
【附图说明】
[0051] 图1 :头抱曲松的保留时间；
[005引图2 :头抱嚷目亏的保留时间；
[0053] 图3 :头抱赃酬的保留时间；
[0054] 图4 :头抱嚷吩的保留时间；
[00巧]图5 :头抱类抗生素的分离谱图；
[005引 图6:头抱曲松标准曲线图；
[0057]图7 :头抱嚷朽标准曲线图；
[005引 图8:头抱赃酬标准曲线图；
[005引图9 :头抱嚷吩标准曲线图。
【具体实施方式】
[0060] 下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容。本领域技术人员应当理解，下述实 施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，W此概括本发明的各参数的相 对范围，因此不能将之理解为对本发明的一种限制。
[0061] 牛奶产品主要分为液态和固态，因此，本发明选择牛奶中最具有代表性的液态奶 和奶粉作为验证的实施例。
[0062] 实施例