胶体考马斯染剂的制作方法
【专利说明】胶体考马斯染剂
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月12日提交的美国临时专利申请第61/777, 801号的优先 权，该文通过引用纳入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 可采用考马斯亮蓝G-250对电泳凝胶进行染色至确定的终点，因为所述染料可以 胶体形式制备，其不进入供染色的凝胶，而是被该凝胶中的蛋白质条带吸附，用充足的时间 来扩散遍及所述条带将条带饱和。因为所述胶体形式不进入凝胶本身，使得背景非常低，由 此降低对脱色步骤的需求，所述脱色步骤可导致染色的蛋白质条带强度下降。
[0005] 通常采用2-部分（two-part)染剂对电泳凝胶进行染色。所述2-部分染剂需在每 次使用之前新鲜配制，以具有所需性能（例如，低背景）。2-部分染剂会快速形成沉淀物， 这使溶液不可使用-通常在24小时内。2-部分染剂制剂还基于甲醇（作为醇）的使用。 简单地用乙醇替代甲醇将使所述制剂的性能不可接受。
【发明内容】
[0006] 提供用于对电泳凝胶中的蛋白质染色的稳定化的胶体染剂制剂。
[0007] 在一些实施方式中，所述制剂包含：考马斯亮蓝；表面活性剂；乙醇；硫酸铵；和 可任选的正磷酸。在一些实施方式中，所述考马斯亮蓝是考马斯亮蓝G-250或考马斯亮蓝 R-250。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。在一些实施方式中，所述制 剂包含0.01-0. 05%重量/重量的考马斯亮蓝；0.01-0. 10%重量/重量的泊洛沙姆407 ; 10-20 %重量/重量的乙醇；5_10 %重量/重量的硫酸铵；和0. 5_5 %的正磷酸。
[0008] 在一些实施方式中，所述制剂包含考马斯亮蓝染料；表面活性剂；乙醇或甲醇；和 硫酸铵。在一些实施方式中，该制剂还包含正磷酸。在一些实施方式中，所述制剂包含乙醇 (并且在一些进一步实施方式中，不包含甲醇）。在一些实施方式中，所述制剂包含甲醇（并 且在一些进一步实施方式中，不包含乙醇）。
[0009] 在一些实施方式中，所述考马斯亮蓝以式1表示。在一些实施方式中，所述考马斯 亮蓝以式2表示。
[0010] 在一些实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂。在一些实施方 式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛 沙姆407。
[0011] 在一些实施方式中，所述制剂包含：0.01-0. 05%重量/重量的考马斯亮蓝染料； 0. 01-0. 10%重量/重量的表面活性剂；10-20%重量/重量的乙醇；5-10%重量/重量的 硫酸铵；和〇. 5-5%正磷酸。在一些实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性 剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。在一些实施方式中，所述 表面活性剂是泊洛沙姆407。
[0012] 还提供采用本文所述的制剂对电泳凝胶中的蛋白质染色的方法。在一些实施方式 中，所述方法包括：使所述凝胶与本文所述的权利要求1~10中任一项所述的制剂在一定 条件下接触充足的时间以对该凝胶中的蛋白质染色，和，检测所述凝胶中至少一个区域内 蛋白质的存在或量。在一些实施方式中，所述制剂在所述接触之前储存至少三天。
[0013] 还提供储存用于电泳凝胶中蛋白质的胶体制剂的方法。在一些实施方式中，所述 方法包括将本文所述的胶体制剂储存至少3 (例如，至少7、10、15、30或更多）天。
[0014] 还提供包含本文所述的胶体制剂的试剂盒。
[0015] 附图简述
[0016] 图1说明染色制剂中普流罗尼克F-127的不同浓度（0. 5% -0. 05% )对染色强度 的影响。
[0017] 图2说明染色制剂中普流罗尼克F-127较低的不同浓度（0. 05%及以下）对染色 强度的影响。
[0018] 发明详述
[0019] 引言
[0020] 发明人发现，通过在所述制剂中纳入表面活性剂和乙醇可生成稳定的胶体考马斯 亮蓝染剂。所得的胶体制剂i)保质期长，ii)环境友好（采用乙醇的低环境影响配方），和 iii)比2-部分染剂更易使用，因为采用所述制剂所需的步骤较少。本文所述的制剂的性能 与传统的保质期短的2-部分胶体考马斯染剂（例如，见述于Neuhoff等，ELECTROPHORESIS 9 (6) : 255 - 262 (1988))基本相同。
[0021] 本文所述的制剂具有至少两个显著方面。首先，采用乙醇作为醇。可使乙醇以及 硫酸铵的量最优化以增加考马斯剂在EtOH对比MeOH中的溶解度，由此允许稳定的胶体考 马斯制剂。
[0022] 第二，添加表面活性剂（例如，普流罗尼克?F_127 ( -般称为泊洛沙姆407))来使 所述制剂稳定并防止沉淀，由此允许长期稳定保质的1-部分溶液。
[0023] 制剂组分
[0024] 用于对蛋白质染色的胶体染料可用于本文所述的制剂。考马斯亮蓝是一类染料的 商品名，此类染料通常用于蛋白质染色。示例包括考马斯亮蓝G-250和考马斯亮蓝R-250。 考马斯亮蓝R-250以式1表示。
[0026] 考马斯亮蓝G-250(CAS编号6104-58-1)与R-250不同，其包含两个甲基基团，如 下方式2所示。 γν ifiHmrm A 说明书 3/5 页
[0028] 考马斯亮蓝R_250(CAS编号6104-59-2)的通用名包括二甲花青亮蓝G，以及 C. I. 42655、C. I.酸性蓝90、艳靛青G，和艳吲哚青G。
[0029] 如上所述，在所述制剂中纳入表面活性剂使所述试剂稳定（例如，无显著沉淀）， 允许所述制剂在使用前的长时间储存（例如，基于加速的保质期研究，至少两年）。鉴于 所述制剂的稳定性，所述制剂可被制备作为" 1-部分"制剂（即，全部染色成分存在于同一 溶液中），由此避免了当前业内实行的由"2-部分"制剂制备新鲜染料溶液的步骤。并不 意在限制可用于所述制剂中的表面活性剂的范围，在一些实施方式中，所述表面活性剂是 含聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特点是，其 具有聚氧丙烯（聚（环氧丙烷））中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯（聚（环氧乙烷））亲水 链。因为该聚合物嵌段部分的长度可定制，存在多种性质稍有差异的不同的泊洛沙姆。泊 洛沙姆共聚物的常用命名采用"P"(表示泊洛沙姆）后跟三个阿拉伯数字，前两个阿拉伯数 字X 100即是聚氧丙烯核心的大致分子量，最末阿拉伯数字X 10即是聚氧乙烯的含量百分 比（例如，P407 =这样的泊洛沙姆，其具有4, 000g/mol的聚氧丙烯分子量和70%的聚氧 乙烯含量）。对于普流罗尼克和辛普罗尼克（Synperonic)泊洛沙姆商品名，这些共聚物的 代称（coding)以一个字母起始以确定其在室温下的物理形式（L =液态，P =糊状，F =片 状（固态））后跟两个或三个阿拉伯数字，在该数字标记中，首个阿拉伯数字（三个阿拉伯 数字中的前两位）乘以300,指示疏水部分的大致分子量；而最末阿拉伯数字XlO即是聚 氧乙烯的含量百分比（例如，L61指示l，800g/mol的聚氧丙烯分子量和10%的聚氧乙烯 含量）。在该给出示例中，泊洛沙姆181(P181)=普流罗尼克L61和辛普罗尼克PE/L 61。 示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于，普流罗尼克F-127、F-108、F-68、P-105、L-35和 P-123。在其它实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂，即，包含一个或多 个聚氧乙基基团的表面活性剂。
[0030] 所述制剂将包含醇，例如，乙醇或甲醇。甲醇曾被用于染剂制剂，因为采用乙醇的 标准制剂具有不可接受的性能问题。然而，如本文中所讨论的，表面活性剂的纳入允许包含 乙醇来代替甲醇。鉴于甲醇的环境和身体危险性，在许多情况下优选