一种用于检测红霉素的荧光偏振免疫分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫分析技术和兽药残留检测领域，具体涉及一种用于检测红霉素的 焚光偏振免疫分析方法。
【背景技术】
[0002] 红霉素（Erythromycin，ERY)是第一个问世的大环内酯类药物，主要用于治疗由 革兰氏阳性菌及支原体引起的畜禽疾病，还被用作饲料添加剂来提高饲料转化率，促进生 长。但是该类化合物在畜禽体内代谢缓慢，易残留在动物体内，能够对机体产生副作用，这 对人们的健康造成一定的威胁。因此，世界各国对红霉素在动物性食品中残留限量均做出 了要求。欧盟自2006年起禁止所有抗生素用作促生长的饲料添加剂使用，EC1181/2002规 定红霉素在畜禽组织中的最高残留限量不得超过200 μ g/kg，我国农业部235号也明确规 定了红霉素在肌肉、牛奶和脂肪等产品中的最高残留限量。
[0003] 目前监测动物源性食品中红霉素残留的方法见报道的主要有仪器检测方法。主要 有：高效液相-串联质谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等，虽然这些仪器方法准确度高、 重复性好、适用于定量检测等优点，但是设备价格昂贵，操作复杂，需要专门的技术人员，难 以实现样品的大规模筛选和推广。
[0004] 免疫检测方法以其灵敏、高效、特异、简便的优点在药物残留检测领域已被广泛应 用。其中常用的酶联免疫吸附方法和免疫测流层析技术，由于需要多步分离和洗涤操作，而 耗时较长。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有的红霉素免疫检测技术中，操作复杂、耗时长等缺点，建立一种用 于检测红霉素的荧光偏振免疫分析方法，整个检测过程只需要一步竞争反应，操作简单、快 速。
[0006] 本发明的目的是提供一种用于检测红霉素的荧光偏振免疫分析方法。
[0007] 本发明所提供的用于检测红霉素的荧光偏振免疫分析方法，包括下述步骤：
[0008] 1)将一系列已知浓度的红霉素标准品的溶液分别与荧光标记物溶液以及红霉素 单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应，测定所得体系的荧光偏振值；以测定的荧光偏振 值为纵坐标，所述一系列已知浓度的磺胺二甲基嘧啶标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲 线；
[0009] 2)以待测样品代替步骤1)中的红霉素标准品，按照步骤1)中的加样量，将所述待 测样品与所述荧光标记物溶液以及所述红霉素单克隆抗体溶液混合，孵育进行竞争反应， 测定所得体系的荧光偏振值，根据步骤1)中的标准曲线，计算出所述待测样品中红霉素的 浓度。
[0010] 上述方法步骤1)中，所述荧光标记物为红霉素半抗原与荧光素的偶联物。
[0011] 所述红霉素半抗原选自下述任意一种：红霉胺（ERM)和羧甲基羟胺改造后的红霉 素半抗原（ERY-CMO)。
[0012] 所述荧光素选自下述任意一种：异硫氰酸荧光素（FITC)、二氯三嗪基氨基荧光素 (DTAF)、AF647羧酸琥珀酰亚胺酯（AF647)以及4' -氨甲基荧光素（4' -AMF)。
[0013] 具体地，所述荧光标记物具有表1所示的结构。
[0014] 表1各焚光标记物的结构
[0015]
[0016] 优选的，所述荧光标记物为ERM-FITC。
[0017] 所述红霉素单克隆抗体选自实验室杂交瘤细胞株5B2、6C1和6D9所 分泌的单克隆抗体5B2、6C1和6D9中的任意一种（Zhanhui Wang et al.，Food Chemistry, 2015, 171，98-107)。
[0018] 优选的，所述红霉素单克隆抗体为5B2。
[0019] 所述一系列已知浓度的红霉素标准品的溶液的溶质为红霉素标准品，溶剂为硼酸 盐缓冲液。
[0020] 所述硼酸盐缓冲液的摩尔浓度为45-55mmol/L，pH值为8. 0-8. 5。
[0021] 所述一系列已知浓度为 1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62. 5ng/mL、 31. 25ng/mL、15. 625ng/mL、7. 8125ng/mL、3. 906ng/mL 和 I. 953ng/mL 10 个梯度浓度。
[0022] 所述荧光标记物溶液的浓度为工作浓度，所述荧光标记物的工作浓度为标记物的 荧光值是背景值（缓冲溶液）10倍时对应的浓度，为15nM。
[0023] 所述红霉素单克隆抗体溶液的浓度为工作浓度，所述抗体结合曲线中50%的抗体 结合时的抗体稀释倍数作为抗体的工作浓度，为8ug/mL。
[0024] 步骤1)和步骤2)中，所述红霉素标准品的溶液、所述荧光标记物溶液和所述红霉 素单克隆抗体溶液以等体积混合，所述体积具体可为70 μ L-100 μ L，具体可为70 μ L。
[0025] 步骤1)和步骤2)中，所述竞争反应的温度为20_25°C，优选为25°C，时间为 l_5min，优选为 2min〇
[0026] 步骤1)和步骤2)中，所述荧光偏振值的测定条件为：当所述荧光标记物为 ERM-FITC、ERM-DTAF 或 ERY-CMO-4' -AMF 时，激发波长为 485nm，发射波长为 530nm，cutoff 值为515nm ;当所述荧光标记物为ERM-AF647时，激发波长为644nm，发射波长为685nm， cutoff 值为 665nm。
[0027] 所述标准曲线的绘制依据OriginPro 8.0软件中的四参数方程进行。
[0028] 步骤2)中，所述待测样品可为动物性食品，具体可为牛奶。
[0029] 上述方法在动物性食品中红霉素含量检测中的应用也属于本发明的保护范围。
[0030] 所述动物性食品具体可为牛奶。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 现有的红霉素检测技术操作繁琐耗时，不能满足高通量快速检测的要求，而且其 他免疫分析方法大多为非均相的反应，需要多步孵育和洗涤步骤，耗时长，操作复杂。针对 这些不足，本发明提供了一种均相的、快速的红霉素荧光偏振免疫检测方法。方法只需要加 样，无需分离和洗涤操作，十分钟内就可获得检测结果。本发明通过对三种单克隆抗体和四 种红霉素荧光标记物的筛选，建立了高效、灵敏的红霉素荧光偏振免疫分析方法。方法在硼 酸盐缓冲溶液中标准曲线的灵敏度为7. 39ng/mL，检测范围为1. 85-29. 47ng/mL，由于牛奶 基质稀释了 14倍，在牛奶中的检测限为14. 08 μ g/L ;该方法快速、简便高通量，而且能够满 足红霉素的残留检测限量要求，非常适合牛奶中红霉素的检测需求。
[0033] 本发明所应用的焚光偏振免疫分析技术（Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA)是一种不需要分离和洗涤的均相免疫分析方法。由于操作简单、快速， 更适用于自动化的高通量筛选等优点，逐渐成为临床、食品和环境等领域中小分子分析的 常用技术。而且，牛奶中红霉素残留的FPIA快速检测技术还未见报道。
【附图说明】
[0034] 图1为四种荧光标记物与三种抗体建立标准曲线的IC5。值比较。
[0035] 图2为硼酸盐缓冲液中红霉素荧光偏振免疫检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0036] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所 用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中所使用的红霉素单克隆抗体为杂交瘤细胞株5B2、6C1和6D9所分泌 的单克隆抗体中的任意一种（Zhanhui Wang et al.，Food Chemistry, 2015, 171，98-107)。
[0039] 实例1、基于半抗原红霉胺的荧光标记物的制备
[0040] 以ERM-FITC为例，合成方法如下：
[0041] 称取0· 2mg红霉胺标准品和Img FITC粉末，加入到200 μ L DMF中振荡至溶解；加 入50 μ L三乙胺，室温避光反应7天；取50 μ L反应液用薄层色谱法（TLC)分离，以纯FITC 为对照，展开剂为二氯甲烷/甲醇（V:V，1:1);刮取硅胶板上刮下Rf= 0. 5的黄色条带，甲 醇洗脱，检测备用。经质谱鉴定，ERM-FITC产物峰m/z为1123. 4。
[0042] 其他红霉胺的荧光标记物如：DTAF、四甲基罗丹明磺酰氯、AF647的反应步骤与 FITC的标记方法类似，荧光标记物存放在4°C。
[0043] 实例2、基于改造后红霉素半抗原的荧光标记物的制备
[0044] 步骤1 :红霉素半抗原的改造
[0045] 将含有44mg羧甲基羟胺NaHCO3调节pH到5-6之间的2mL蒸馏水逐滴加入到含有 IOOmg红霉素原料的ImL无水乙醇中；置50°C恒温水浴中搅拌反应5h ;反应结束后，自然冷 却至室温，加水淬灭，调节溶液pH值为酸性；用二氯甲烷萃取两遍，合并二氯甲烷层，加入 无水Na 2SO4振摇，静置过夜；取二氯甲烷层，40 °C减压旋蒸至干，用5mL DMF溶解，-20 °C保 存。
[0046] 步骤2 :改造后红霉素荧光标记物（ERY-CMO-4' -AMF)的合成
[0047] 称取 200 μ L ERY-CMO 的 DMF 溶液与含有 0· 4mg NHS 与