一种基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于电化学分析检测技术领域，具体涉及一种基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种由于胰岛素缺乏所致的以高血糖为特征的代谢性疾病，是导致死亡和伤残的原因之一。诊断和控制糖尿病需要随时监测血液中的葡萄糖水平，因此成千上万的糖尿病患者需每天检测血糖。如何进行可靠、密切地血糖控制仍I日是一个值得研究的课题。其中，在血糖监测中，葡萄糖电化学生物传感器起着重要的作用，而以电极上固定葡萄糖氧化酶为基础的电流型酶电极被广泛应用于葡萄糖电化学生物传感器的研究中。
[0003]近年来葡萄糖检测已经从人工肉眼观察化学反应的阶段逐步发展为自动化设备监测，运用电化学反应测定血糖，快速灵敏，已经成为研究和应用的一大趋势。葡萄糖氧化酶检测葡萄糖具有极高特异性，将葡萄糖氧化酶固定在电极表面，运用电化学方法将生物化学反应信号转化为电信号，能够提高检测的灵敏度及准确度。现有的葡萄糖氧化酶电极在酶的固定、重复利用及检测灵敏度方面有待改进。Juan Tian等人直接利用氧化石墨烯构建电极来进行信号放大，然而氧化石墨烯在水中溶解度较高，在水体系检测中，电极的重复利用度低，此外氧化石墨稀的导电性较差(Tian J, Yuan P X，Shan D, et al.B1sensingplatform based on graphene oxide via self-assembly induced by synergicinteract1ns[J].Analytical b1chemistry, 2014，460:16-21.)0
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种制备方法简便、检测限低、灵敏度高、酶结合强度高的基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极及其制备方法。
[0005]为了达到上述目的，本发明提供了一种基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极，该电极依次由导电电极基底、石墨烯衍生物/多巴胺复合层、聚多巴胺层、纳米金阵列、4-巯基苯硼酸(MPBA)层、和葡萄糖氧化酶层组成，所述的石墨烯衍生物/多巴胺复合层为多巴胺与氧化石墨烯混合后，多巴胺与部分氧化石墨烯发生氧化还原反应后的混合物。
[0006]所述导电电极基底选自碳基电极基底、导电金属电极基底或半导体电极基底。
[0007]本发明的葡萄糖氧化酶电极运用纳米材料层层放大信号，降低检测限，提高了检测灵敏度；在氧化石墨烯的基础上引入还原型氧化石墨烯，提高了疏水性且增强了电极的导电性；利用MPBA —端的巯基与纳米金结合，同时另一端的羟基捕捉葡萄糖氧化酶，在不影响灵敏度的情况下显著提高了结合强度。
[0008]本发明还提供上述葡萄糖氧化酶电极的制备方法，具体步骤如下:首先将等质量的盐酸多巴胺和氧化石墨烯溶于PH值为8.5的Tris-HCl缓冲液中，分散均匀后反应，然后离心清洗、干燥即得石墨烯衍生物/多巴胺复合物，再将复合物溶解制备成石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液，并采用石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液修饰导电电极基底，之后采用电化学法在电极表面电聚合多巴胺，再依次采用纳米金溶液和4-巯基苯硼酸溶液修饰电极，最后用葡萄糖氧化酶溶液修饰电极，即得所述的葡萄糖氧化酶电极。
[0009]所述的电化学法为以石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液修饰过的导电电极基底为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，浓度为4mM、pH值为7.5的多巴胺磷酸缓冲溶液为电解液，利用电化学工作站的循环伏安扫描，在工作电极表面电聚合多巴胺。
[0010]所述的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液的浓度为0.5?3mg/mL，4-巯基苯硼酸的浓度为I?10mM，葡萄糖氧化酶的浓度为10?12mg/mL。
[0011 ] 进一步地，所述的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液的浓度优选为I?2mg/mL。
[0012]进一步地，4-巯基苯硼酸的浓度优选为5?8mM。
[0013]本发明与现有技术相比，其显著优点是:(1)电极制备过程简单快速；(2)该体系用多层纳米材料对信号进行层层放大，得到的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖有高检测灵敏度及宽线性检测范围，检测速度快；(3)利用还原型氧化石墨烯，提高了疏水性且增强了电极的导电性，利于电极的重复利用；(4)MPBA分别与纳米金及葡萄糖氧化酶稳固结合，在不影响灵敏度的情况下显著提高了结合强度，具有良好的稳定性。
【附图说明】
[0014]图1为本发明的基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极的构建过程示意图。
[0015]图2为实施例1制备得到的纳米金的紫外光谱表征图。
[0016]图3为实施例5中葡萄糖氧化酶电极检测葡萄糖的时间-响应电流曲线，内插图为900-1300秒的时间-响应电流放大图。
[0017]图4为实施例5中葡萄糖氧化酶电极检测葡萄糖的浓度-响应电流曲线，内插图为葡萄糖浓度-电流校正曲线。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0019]基于石墨烯衍生物的葡萄糖氧化酶电极的制备方法，具体步骤如下:
[0020]步骤1、基底电极抛光、清洗后吹干；
[0021]步骤2、将等质量的盐酸多巴胺和氧化石墨烯溶于pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中，分散均匀后搅拌反应然后离心清洗，干燥即得石墨烯衍生物/多巴胺复合物，之后将复合物溶解制备浓度为0.5?3mg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液；
[0022]步骤3、将步骤2得到的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液滴涂在处理过的导电电极基底；
[0023]步骤4、以步骤3得到的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，浓度为4mM、pH值为7.5的多巴胺磷酸缓冲溶液为电解液，利用电化学工作站的循环伏安扫描，在工作电极表面电聚合多巴胺；
[0024]步骤5、根据Frens法制备纳米金，将质量分数为I %柠檬酸钠溶液加入到质量分数为1%四氯金酸溶液中，加热煮沸，直至溶液呈酒红色，冷却即得纳米金溶液；
[0025]步骤6、将步骤5得到的纳米金滴涂在步骤4得到的电极，自组装40min，纳米金与多巴胺有序结合；
[0026]步骤7、将I?1mM的MPBA溶液滴涂在步骤6得到的电极，室温2h，冲洗干燥；
[0027]步骤8、将5?15mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液滴涂在步骤7得到的电极，即得葡萄糖氧化酶电极。
[0028]实施例1
[0029]步骤1、将铂电极分别用粒径为0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3悬浊液在麂皮抛光成镜面，再依次用无水乙醇和超纯水各超声2min，置于干燥器内干燥备用；
[0030]步骤2、将30mg盐酸多巴胺溶于PH = 8.5Tris_HCl溶液中，然后加入等质量的氧化石墨烯，超声分散均匀，搅拌反应4h后，于14000rpm、4°C离心30min，去上清液，二次蒸馏水离心清洗三次，之后将沉淀烘干，二次蒸馏水溶解复合物，超声至均匀分散制备0.5mg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液；
[0031 ] 步骤3、滴加1yL步骤2得到的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液在处理过的铂电极上；
[0032]步骤4、以步骤3得到的电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，浓度为4mM、pH值为7.5的多巴胺磷酸缓冲溶液为电解液，利用电化学工作站的循环伏安扫描，在工作电极表面电聚合多巴胺，扫描电压为-0.6?0.6V，扫描速度为50mV/s，扫描段数为20 ;
[0033]步骤5、纳米金的制备方法根据Frens法进行改进，锥形瓶经王水处理后，加入10mL沸腾的二次蒸馏水，随后加入ImL I %四氯金酸溶液，剧烈搅拌，立即顺漩涡方向加入2.5mLl %梓檬酸钠溶液，溶液由无色变为蓝色变为酒红色后，持续沸腾lOmin，然后停止加热搅拌冷却至室温即得纳米金溶液；
[0034]步骤6、滴加10 μ L的步骤5得到的纳米金溶液在步骤4得到的电极上，自组装40min，纳米金与多巴胺有序结合；
[0035]步骤7、滴加10 μ L的ImM的MPBA溶液在步骤6得到的电极上，室温静置2h后冲洗干燥；
[0036]步骤8、滴加10 μ L的5mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液在步骤7得到的电极上，室温静置6h，即得葡萄糖氧化酶电极。
[0037]步骤2用Frens法制备得到的新鲜纳米金胶体用二次蒸馏水稀释10倍后用紫外-可见光谱仪检测，结果如图2所示。从图中可知，523nm处为最大吸收峰，由胶体金颗粒粒径与最大吸收峰之间的回归曲线方程Y = 0.786X+505.53可计算得到制备的纳米金颗粒直径大约为22nm。制备得到的纳米金颜色为酒红色，尺寸分布均匀，未发生团聚现象。
[0038]实施例2
[0039]步骤1、将铂电极分别用粒径为0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3悬浊液在麂皮抛光成镜面，再依次用无水乙醇和超纯水各超声2min，置于干燥器内干燥备用；
[0040]步骤2、将30mg盐酸多巴胺溶于PH = 8.5Tris_HCl溶液中，然后加入等质量的氧化石墨稀，超声分散均勾，搅拌反应4h后，于14000rpm、4°C离心30min，去上清液，二次蒸馏水离心清洗三次，之后将沉淀烘干，二次蒸馏水溶解复合物，超声至均匀分散制备lmg/mL的石墨烯衍生物/多巴胺复合物溶液；
[0041 ] 步骤3、滴加1yL步骤2得到的