一种快速检测全血红细胞十八烷二烯酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，涉及一种快速检测全血红细胞十八烷二烯酸的方 法。
【背景技术】
[0002] 在人体内，少量脂肪酸以游离形式存在，大部分以结合形式，如甘油三酯、磷脂、糖 脂等存在。从营养学角度，脂肪酸可分为必需脂肪酸和非必需脂肪酸，非必需脂肪酸是指机 体可以自行合成，不必依靠食物供应的脂肪酸；必需脂肪酸是指人体维持机体正常代谢不 可缺少而自身又不能合成或合成速度慢，无法满足机体需要，必须通过食物供给的脂肪酸。 必需脂肪酸可分为ω (Omega)-6系列脂肪酸和ω (Omega)-3系列脂肪酸。膳食中必需 脂肪酸缺乏将导致皮肤病变、神经和视觉疑难症、心脏疾病等问题。
[0003] 由于红细胞膜上脂肪酸的组成能够反映人群的长期饮食结构，而不会受到短期内 饮食的影响。因此，测定人全血红细胞脂肪酸，能够准确、客观的反映机体内不同脂肪酸的 营养水平。
[0004] 国内外有关脂肪酸检测的相关报道盛多，涉及到食品、环境、医药卫生、临床应用 等多个领域，检测方法包括气相色谱法（GC)、气相色谱-质谱法（GC-MS)和液相色谱-串联 质谱法（LC-MS/MS)，检测样本类型更是涉及食物、水质、药品、血液、组织等。但是，不同的应 用领域及不同的样品类型，所涉及的样品处理与脂肪酸检测分析流程千差万别，因此不同 领域以及不同样品类型的脂肪酸检测方法之间无可比性。
[0005] 目前，全血红细胞脂肪酸的检测主要有GC、GC-MS和LC-MS/MS三种。GC是目前 红细胞脂肪酸检测的常用方法，但是此方法的检测器对未实现色谱分离的类似脂肪酸，无 法实现准确定性分离和定量分析，因此无法对多种脂肪酸特异性、准确的定性和定量分析。 LC-MS/MS方法前处理较为复杂，且分析结果重现性较差。而GC-MS方法由于同时具有气相 的分离功能和质谱的特异性定性、定量功能，所以可以解决GC和LC-MS/MS的弊端，但是现 有的GC-MS方法分析时间较长，检测通量较低。
[0006] 中国专利201210247480. 2公开了一种气相色谱-质谱联用检测脂肪酸含量的方 法，该方法针对的样品为动物组织，样品的前处理包括皂化步骤，还需要充氮气保护，样品 的前处理复杂。 因此，本领域技术人员迫切需要一种前处理简单、检测快速、方法灵敏度高、特异性强 的适用于全血红细胞脂肪酸的检测方法。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种快速检测全血红细胞十八烷二 烯酸的方法，该方法的样品用量少，前处理简单，灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大， 并且整个检测过程时间短、检测通量高。本发明仅涉及全血样本红细胞十八烷二烯酸的检 测。
[0008] -种快速检测全血红细胞十八烷二烯酸的方法，包括如下步骤： A) 全血样品的前处理：从全血样品中分离红细胞，加入内标溶液和盐酸-甲醇溶液进 行衍生化反应，然后加入萃取剂萃取，取上清液并氮气吹干，残渣中加入复溶剂，混匀，得到 样品检测液； B) 对所述样品检测液采用气相色谱-质谱仪进行检测，气相色谱条件包括：色谱柱采 用极性色谱柱，载气为氦气，不分流进样，线速度流量控制方式，载气流量为0. 80~1. OOmL/ min，起始柱温60°C，先升温至180°C，然后升温至220°C，整个升温程序的梯度时间为 8~15min ;质谱条件为：采用电子轰击离子源，采用全扫描和选择离子扫描方式。
[0009] 采用上述技术方案，前处理简单，通过萃取-吹干-复溶的过程，有效去除了干扰 物质，使红细胞中的十八烷二烯酸转化为挥发性较强、适用于气相色谱质谱仪检测的十八 烷二烯酸甲酯产物；检测方法的灵敏度高，特异性强，定性、定量功能强大，准确性好，并且 整个检测过程时间短、检测通量高。
[0010] 优选地，所述内标溶液选自十七烷酸。除十七烷酸，外本发明还可以选用十五烷酸 或十九烷酸作为内标溶液。
[0011] 优选地，所述萃取剂选自正己烷，所述复溶剂选自正己烷。使用正己烷作为萃取 剂，可以将各种脂肪酸的甲酯化产物萃取出来，萃取效率高且有效避免了其他物质的干扰。
[0012] 优选地，所述内标溶液与红细胞的体积比为1 : (1~2);所述红细胞、盐酸-甲醇溶 液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :(1〇~25) :(20~50) :(4~10)。
[0013] 优选地，所述红细胞、盐酸-甲醇溶液、萃取剂及复溶剂的体积比为1 :20 :40 :8。
[0014] 优选地，所述极性色谱柱选自规格为20m*0. 20 μ m的极性毛细管色谱柱。
[0015] 优选地，所述气相色谱条件还包括：进样体积为WL，进样口温度为220~230°C， 后运行温度为240~250 °C，后运行时间为2min，吹扫流量为3. 0~5. OmL/min，总流量为 50. 0~60· O mL/min，平均线速度为 35. 0~45· Ocm/s。
[0016] 优选地，所述质谱条件还包括：接口温度为210~230°C ;离子源温度为220~240°C ; 四极杆温度为140~160°C，溶剂延迟时间为3. 0~4. Omin，全扫描范围为m/z 60. 00~450. 00。
[0017] 优选地，所述检测方法还包括如下步骤：检测结果的定性判断和/或定量计算。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的检测方法可以实现全血样 品红细胞中十八烷二烯酸的定性和定量检测，具有前处理简单，有效去除了干扰物质，灵敏 度高，特异性强，定性、定量功能强大，准确性好，并且整个检测过程时间短、检测通量高。
[0019] 本发明采用全扫描和选择离子扫描同时进行的扫描模式，能够得到样品的总离子 流色谱图和选择离子色谱图，总离子流色谱图可以用于对化合物进行定性，用于检测过程 中监测出峰时间处的化合物是否为目标化合物，以免出现其他干扰。此外，选择离子扫描对 每个化合物的特征离子进行扫描，解决了单独使用气相色谱对脂肪酸进行定量不够准确的 问题，进一步提高了检测准确度和方法的特异性。本发明所使用的极性色谱柱适合十八烷 二烯酸的分离分析，色谱柱的高柱效以及低流失，大大降低了质谱检测时的背景干扰，最低 检出限达到了 〇.〇lmg/L，检测灵敏度高。按本发明提供的检测方法，单个样品检测时间为 12min，与现有传统方法相比，检测时间短，仪器检测通量高。
【附图说明】
[0020] 图1十八烷二烯酸甲酯的标准曲线。
[0021] 图2全血红细胞样品中脂肪酸甲酯的总离子流色谱图。
[0022] 图3全血红细胞样品中十八烷二烯酸甲酯的选择离子色谱图。
[0023] 图4全血红细胞样品中十七烷酸甲酯的选择离子色谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0025] 实施例一全血样品的前处理 将抗凝全血样本混匀，离心，弃除上层血浆、白细胞、血小板等；向剩余红细胞中加入等 体积的生理盐水，混匀后离心，弃除上层的生理盐水；再向剩余的红细胞中加入等体积的生 理