一种用于瘦肉精检测的无标记电化学免疫传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于二硫化钼/银钯合金纳米复合材料构建的无标记电化学免 疫传感器的制备方法，所制备的传感器可用于瘦肉精的检测。属于新型纳米功能材料与食 品安全分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 瘦肉精是一类叫做β -兴奋剂（β-agonist)的药物，而不是某一种特定的药物。 根据国务院食品安全委员会办公室《"瘦肉精"专项整治方案》（食安办〔2011〕14号）规定 的"瘦肉精"品种目录为16种，包括：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐 酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、 马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。因为它们可以促进动 物体蛋白质沉积和脂肪分解，抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转 化率，被用作牛、羊、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。但瘦肉精有很危险的副作用，当人 们食用含有瘦肉精的肉制品时，会造成心血管系统的损坏，并可能出现严重的神经症状。因 此，研发快速、灵敏检测瘦肉精的检测方法对于人们的日常生活至关重要。
[0003] 电化学免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于食 品分析和环境检测等领域，其中，无标记电化学免疫传感器因其制备相对简单、受环境影响 小等优点，具有更广阔的应用前景。构建无标记的电化学免疫传感器，关键的技术是提高修 饰电极对抗体的固定量和对测试底液的信号响应速度和大小。
[0004] 二硫化钼，化学式为MoS2,英文名称为molybdenum disulfide，是辉钼矿的主要成 分，是应用最广泛的固体润滑剂之一。其纳米二维结构，是性能优异的半导体纳米材料，除 了具有大的比表面积，可以作为催化剂和生物抗体的载体，提高负载量，同时作为助催化剂 也具有优良的电子传递性能。
[0005] 目前，大多数的合成手段都是分开合成后，再将催化剂与载体进行复合，过程繁 琐，产率不高。因此，对于一锅法制备具有优良催化性能的催化剂具有广泛的应用前景和重 要的科学意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、特异性强的可用于检测瘦肉精 的无标记电化学免疫传感器的制备方法。基于此目的，本发明先采用一锅法制备出二硫化 钼/银钯合金纳米复合材料M 〇S2/AgPd，并利用其对电极进行修饰，有效提高了电极的比表 面积，增大了抗体的吸附量；并且极大增强了电极的电子响应速度和对测试底液的电催化 信号强度等性能；然后通过吸附作用，固定瘦肉精抗体。在进行检测时，利用抗体与抗原的 特异性定量结合，使得电极对H 2O2的电流响应信号相应降低，从而实现了采用无标记的电 化学方法检测瘦肉精的免疫传感器的构建。
[0007] 本发明采用的技术方案如下： 1. 一种用于瘦肉精检测的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步 骤为： (1) 取35 mL的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液，加入0. 01~0. 03 g硝酸银AgNOjP 2~6 mL的氯钯酸H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入2~6 mL的抗坏血酸溶 液，0. 5~1. 5 mL的钼酸钠 Na2MoO4溶液和0. 01~0. 03 g硫化钠 Na 2S，搅拌15分钟后，放入 反应釜中，在150~220°C下，反应12~16小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在40 °(：下进行真空干燥，即制得二硫化钼/银钯合金纳米复合材料M 〇S2/AgPd，将其溶于去离子 水制得M〇S2/AgPd溶液； (2) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5~12 PL的MoS2AgPd溶液， 室温下晾干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用去离子水清洗，室温下晾干成膜，在电极表面滴涂5~12 KL的瘦肉精抗体溶液，4 °C冰箱中保存晾干； (4) 将步骤（3)中得到的电极用去离子水清洗，继续在电极表面滴涂5~10 PL的牛血清 白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存晾干，用去离子水清洗，4 °C冰箱中晾干成膜，制得无 标记电化学免疫传感器； 所述的CTAB溶液的浓度为0· I mol/L，所述的H2PdCl4浓度为0.03 mol/L，所述的抗坏 血酸溶液浓度为〇· 3 mol/L，所述的似#〇04溶液浓度为0· I mol/L ; 所述的MoS2/AgPd溶液浓度为I mg/mL ; 所述的瘦肉精抗体溶液浓度为10 Kg/mL ; 所述的BSA溶液浓度为100 Pg/mL。
[0008] 2.本发明所述的制备方法所制备的瘦肉精电化学免疫传感器，其特征在于，所述 的无标记电化学免疫传感器的用途为可用于瘦肉精的快速、灵敏检测。
[0009] 3.本发明所述的无标记电化学免疫传感器的用途，其特征在于，检测瘦肉精的检 测步骤为： (1) 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为 pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液； (2) 工作电极修饰：将本发明所述的无标记电化学免疫传感器作为工作电极，将步骤 (1) 中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 tC冰箱中保存； (3) 工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤 (2) 所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入10~25 mL pH=7. 0~8. 0的PBS缓冲溶液和20 PL浓度为3~6 mol/L的H2O2;通过计时电流法检测 组装的工作电极对H2O 2的响应；空白标样的响应电流记为/。，含有不同浓度的瘦肉精标准 溶液的响应电流记作Λ，响应电流降低的差值为A /= /〇-Λ，与瘦肉精标准溶液的质量 浓度Ct间成线性关系，绘制Δ /- CC作曲线； (4) 瘦肉精的检测：用待测样品代替步骤（1)中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2)和（3) 中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值Ai^P工作曲线，得到待测样品中瘦肉精的 含量。
[0010] 4.本发明所述的无标记电化学免疫传感器的用途，其特征在于，所述的瘦肉精选 自下列之一：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸 特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布 特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗 本发明的有益成果 (1)本发明所述的无标记电化学免疫传感器的制备方法，制备过程简单、操作方便，所 制备的传感器可以实现对样品中瘦肉精的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景。 [0011] (2)本发明首次采用一锅法制备了 M〇S2/AgPd，并将其应用于无标记电化学免疫传 感器的制备中，利用MoS2AgPd的大比表面积以增大抗体的吸附量、高催化活性以提高电化 学响应信号强度及其高电子传递速率以提高电化学响应信号速度，显著增强了电极对H2O2 的响应速度和强度，大大提高了电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用 价值。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 MoS2AgPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 01 g的AgNOjP 2 mL浓度为0. 03 mol/L的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入2 mL浓度为0· 3 mol/L的抗坏 血酸溶液，〇. 5 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 01 g的Na 2S，搅拌15分钟后，放 入反应釜中，在180°C下，反应14小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在40 °C下 进行真空干燥，即制得MoS2/AgPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/AgPd溶 液。
[0013] 实施例2 MoS2AgPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 02 g的AgNOjP 4 mL浓度为0. 03 mol/L的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入4 mL浓度为0· 3 mol/L的抗坏 血酸溶液，1. 〇 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 02 g的Na 2S，搅拌15分钟后，放 入反应釜中，在150°C下，反应16小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在40 °C下 进行真空干燥，即制得MoS2/AgPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/AgPd溶 液。
[0014] 实施例3 MoS2AgPd的制备方法 取35 mL浓度为0.1 mol/L的CTAB溶液，加入0. 03 g的AgNOjP 6 mL浓度为0. 03 mol/L的H2PdCl4溶液，搅拌15分钟后，继续搅拌并相继加入6 mL浓度为0· 3 mol/L的抗坏 血酸溶液，I. 5 mL浓度为0.1 mol/L的Na2MoO4溶液和0. 03 g的Na 2S，搅拌15分钟后，放 入反应釜中，在220°C下，反应12小时；冷却至室温后，使用去离子水离心洗涤，在40 °C下 进行真空干燥，即制得MoS2/AgPd，将其溶于去离子水制得浓度为I mg/mL的MoS2/AgPd溶 液。
[0015] 实施例4无标记电化学免疫传感器的制备方法 (1) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 PL实施例1中制得的 M〇S2/AgPd溶液，室温下晾干； (2) 将步骤（1)中得到的电极用去离子水清洗，室温下晾干成膜，在电极表面滴涂5 PL 浓度为10 Kg/mL的瘦肉精抗体溶液，4 °C冰箱中保存晾干； (3)将步骤（2)中得到的电极用去离子水清洗，继续在电极表面滴涂5 PL浓度为100 Pg/mL的BSA溶液，4 °C冰箱中保存晾干，用去离子水清洗，4 °C冰箱中晾干成膜，制得无 标记电化学免疫传感器。
[0016] 实施例5无标记电化学免疫传感器的制备方法 (1) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂8 PL实施例2中制得的 M〇S2/AgP