[0028] 3)磁珠与蛋白的链接；
[0029] 在已处理好的磁珠中加入50 μ L LAM多克隆抗体（lmg/ml)和500 μ L PBS (ΡΗ5. 5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
[0030] 用PBS缓冲液（ΡΗ5. 5,0· 05 % Tween)清洗3次，弃上清；
[0031] 加入1ml Tris缓冲液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育 2小时；
[0032] 加入1ml PBS缓冲液（PH5. 5,0· 05% Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入 Iml PBS缓冲液（PH5. 5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
[0033] 加入 Iml PBS 缓冲液（pH = 7. 4,0· 05% Tween-20,0· 1 % BSA，0· 05NaN3)，待用；
[0034] (4)制备LAM系列标准品；
[0035] LAM(本室制备，lmg/ml)，PBS (PH7. 4)缓冲液稀释至 0· 5、1. 0、2· 5、5· 0、10. 0、 20.Ong/ml〇
[0036] (1)各取50 μ L各浓度的LAM标准品于EP管中，另取1支EP管加入 50 μ LPBS (ΡΗ7. 4)缓冲液作为阴性对照；
[0037] (2)以上各管加入荧光标记的LAM单抗50 μ L，37°C反应30分钟；
[0038] (3)取完成预处理纳米免疫磁珠100 μ L，用PBS缓冲液（ΡΗ7· 4)稀释至1000 μ L ; 吸取50 μ L免疫磁珠，加入所述试管中，37 °C反应15分钟；加入500 μ LddH2O,磁板上静置2 分钟，弃上清，重复该步骤3次；
[0039] 所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：
[0040] 制备LAM多克隆抗体包被的纳米磁珠（购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司北京 生物技术研究所）：
[0041] 1)纳米磁珠的预处理：
[0042] 轻轻混勾磁珠悬浮液，吸取0.0 lml悬浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP试管中；再加 入0.1 ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤 1次；
[0043] 加入1ml 0.1 M的乙磺酸溶液（pH = 5. 0, MES)，重悬磁珠；
[0044] 2)纳米磁珠的活化
[0045] 将上述EP管置于磁板上，用ImlMES洗涤2次，弃上清；
[0046] 临用前配置终浓度为0.1 M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述 两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用）。用该液重悬磁珠；
[0047] 用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
[0048] 3)磁珠与蛋白的链接；
[0049] 在已处理好的磁珠中加入50 μ L LAM多克隆抗体（lmg/ml)和500 μ L PBS (ΡΗ5. 5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
[0050] 用PBS缓冲液（ΡΗ5. 5,0· 05 % Tween)清洗3次，弃上清；
[0051] 加入1ml Tris缓冲液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育 2小时；
[0052] 加入1ml PBS缓冲液（PH5. 5,0· 05% Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入 Iml PBS缓冲液（PH5. 5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
[0053] 加入 Iml PBS 缓冲液（pH = 7. 4,0· 05% Tween-20,0· 1 % BSA，0· 05NaN3)，待用；
[0054] (4)各管加入100 μ L PBS缓冲液（PH7. 4)，混勾，用便携式流动进样荧光检测 器（为中科院理论物理所制备的样机，该设备固化为激发光波长为777nm，发射光波长为 790nm)进行荧光强度测定；
[0055] (5)结果判断
[0056] 定性检测以阴性对照荧光强度值的2倍作为Cutoff值；
[0057] 定量检测以荧光发射强度和对应的LAM标准品浓度进行回归分析，建立标准曲 线，并拟合方程。
[0058] 有益效果：
[0059] 1、典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒（ns)，这与很多生物样本的自发荧 光衰减时间相当。而近红外荧光寿命长达数十纳秒（20_50ns)，这使得在光激发数纳秒以 后，大多数的自发荧光背景己经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的 荧光信号。此外，由于近红外荧光染料的摩尔消光系数比通常的有机荧光染料高出10-50 倍，它发射的荧光强度是有机染料的10-20倍。
[0060] 2、采用纳米磁珠作为包被载体，优点在于增加了抗原抗体的接触面积，增加了反 应机会，同时由于反应是在液体环境中进行，有利于蛋白质的空间构象展开，可以大大加快 反应速度，减少反应时间。
[0061] 3、采用纳米磁珠作为反应环境介质，也为结合物和游离物的有效快速分离提供可 能。
【附图说明】
[0062] 图I LAM检测标准曲线图
[0063] 图中，X轴：焚光发射强度；Y轴：标准品浓度
【具体实施方式】
[0064] 本发明将结合附图通过以下实施例作进一步说明。实施例：
[0065] -种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂盒，所 述试剂盒由近红外荧光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、磁性分离器、 蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为兔抗LAM ;包被纳米 磁珠的多克隆抗体为兔多抗LAM。建立L-阿拉伯糖标准品梯度浓度和荧光发射值之间的工 作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标多糖含量的定量（定性） 检测。
[0066] 优选地，所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm的荧光 分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。
[0067] 所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌LAM检测试剂 盒的制备方法，步骤如下：
[0068] (1)制备近红外荧光染料标记的LAM单克隆抗体；
[0069] 将 Dylight800 (购自 Thermofisher 公司）用 PBS 缓冲液（PH7. 4)稀释 10 倍，取 1. 4 μ L与20 μ g兔抗LAM单克隆抗体（lmg/ml)(贝勾自Mossman Associates Inc公司）轻 柔混合均匀后于室温避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4°C，PBS缓 冲液透析4小时。标记好的抗体溶液中添加终浓度为I. 5% BSA和0. 1% TWeen20,叠氮化 钠0. 1%。，4°(：保存；使用前将标记产物以PBS稀释2000倍；
[0070] (2) LAM多克隆抗体的制备
[0071] 1)LAM 的提纯：
[0072] 将MTB H37RV接种在罗氏鸡蛋培养基上，37°C培养3~4周，收取菌落置于5mlEP 管中，100°C水浴灭活2小时，用2mlPBS(PH7.4)缓冲液洗涤2次，离心弃上清（8000r/ min);加入2ml氯仿/甲醇（2 : 1)混合液脱脂3次，离心弃上清（8000r/min);加入 2mlPBS (PH7. 4)悬浮，冰浴超声破碎（超声10s，停10s，共30min)，8000r/min离心取上清， 加入2ml40%的苯酚萃取70°C，1小时，8000r/min离心取上清，用蒸馏水透析2天，采用 Sephacryl S-100 凝胶柱层析，用 NaCl (0· 05mmol/L)溶液洗脱，流速 0· 5ml/min。EP 管收 集。
[0073] 2) LAM 的定量：
[0074] 取浓硫酸1m