人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及乙酰苯丙氨酸的检测技术领域，尤其涉及一种利用表面增强激光拉曼 光谱检测乙酰苯丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 乙酰苯丙氨酸在人体内肝细胞中经过羟化酶的作用，代谢为酪氨酸，在酶的作用 下进一步分解为尿黑酸，尿黑酸经过酶的作用转化为乙酰乙酸，最后经过酶的水解作用，最 终代谢产物为二氧化碳和水。肝细胞发生病变后，会影响乙酰苯丙氨酸的代谢过程，因此， 通过研究人体血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，有助于研究肝细胞病变过程，例如，通过研 究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量变化，可以了解肝癌细胞的生长和破坏机理等。
[0003] 目前乙酰苯丙氨酸的分析技术主要有色谱、质谱、核磁共振及液质联用和气质联 用技术等，它们都有各自的优势与适用范围。但这些设备昂贵、操作复杂、分析周期长，无法 满足大批量样品快速检测的需求，也难以进行普及。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法， 具有准确、快速、无损、低成本的特点，能够满足大批量样品快速检测的需求，易于普及，尤 其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种人体血清中乙酰苯丙氨 酸的快速检测方法，包括如下步骤： 51、 样品前处理： 按体积比量取血清样品0. 15~0. 25份，体积为m，溶于0. 45~0. 75份的提取试 剂中，混匀定容，体积为V，控温〇°C~-4tC，经离心机离心沉底，分层；分离得到上清液， 于-18°C~-25°C条件下冷冻一段时间，再取出控温(TC~-4°C，用离心机再次离心沉底，分 层；将再次分离所得上清液过〇. 22 μ m~0. 45 μ m的有机系滤膜，所得滤液即为样品待测 液； 所述提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2. 5~3. 5份、乙腈1. 5~2. 5份和 N，N-二甲基甲酰胺0.5~1.5份，混合置于容器内，-18°C~-25°C密闭保存，用时摇匀； 52、 表面增强激光拉曼光谱检测： 样品待测液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，再用激光拉曼光谱仪扫描，根据 1002cm iiScm 1对应峰的强度，从标准曲线上查出对应的乙酰苯丙氨酸含量为c(mg/L)，将 所述m、V、c按式?:计算，
得到X (mg/L)，即为血清样品中乙酰苯丙氨酸的含量。
[0006] 进一步地，所述步骤SI中，血清样品与提取试剂采用涡旋混匀，-18°c~-25°c条 件下冷冻10分钟，离心机10000转/分钟，每次离心3分钟。
[0007] 进一步地，所述步骤Sl中，所述有机系滤膜为尼龙滤膜。
[0008] 进一步地，所述提取试剂的制备方法中，混合后液体于-18°c~-25°c保存24小 时。
[0009] 进一步地，所述步骤S2中，表面增强试剂为金纳米溶胶，无机盐凝聚剂为氯化钠 溶液。
[0010] 进一步地，按体积比，0. 1份待测液中依次加入0. 3份金纳米溶胶、0. 1份氯化钠 溶液。
[0011] 所述步骤S2中，标准曲线的绘制方法为： A、 乙酰苯丙氨酸标准溶液配制：准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶 中，加水定容至刻度，配制成浓度为I. 0 mg/mL的标准储备溶液，根据血清样品中的浓度范 围进行适当稀释，制成不同浓度的系列标准溶液； B、 将制得的系列标准溶液中依次加入表面增强试剂、无机盐凝聚剂，加入量与样品待 测液的加入量相同，再分别用激光拉曼光谱仪扫描，记录1002cm iiScm 1对应峰的强度，将 标准溶液的浓度与其对应峰强度制成标准曲线。
[0012] 本发明上述人体血清中乙酰苯丙氨酸的快速检测方法，尤其适用于肝癌患者血清 中乙酰苯丙氨酸含量的测定。肝细胞肝癌（HCC)是最常见的腹内恶性肿瘤之一，占原发 性肝癌（PHC)的91. 5%，在世界范围内其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的第5位和第3 位，同时它的5年生存率还不到7%。目前我国肝癌的发病人数占全球的55%，其死亡率排在 恶性肿瘤的第2位，是严重威胁我国人民生命健康的疾病。通过研究肝癌患者血清中乙酰 苯丙氨酸的含量变化，对了解肝癌细胞的生长和破坏机理具有十分重要的意义，为肝癌细 胞的研究提供了一条新的途径。
[0013] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于： 1)本发明提取试剂可高选择性沉淀大分子蛋白，降低杂质干扰，保留病变肝细胞代谢 标志物乙醜苯丙氣酸，有效提尚目标物提取率，提尚检测的灵敏度。
[0014] 2)本发明选用纳米增强试剂金纳米溶胶和无机盐凝聚剂氯化钠溶液，并筛选出最 优添加量，大大提高了检测灵敏度。
[0015] 3)本发明确定了乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱特征定性波数，首次将该技术应用 到肝癌血清中乙酰苯丙氨酸的定性定量检测，具有准确、快速、无损、低成本的特点，一个样 品检测时间小于15分钟，灵敏度高，检出限达到3. 0 mg/L，检测成本低至2元/个样品，检 测方法简单、易学，读数直观、方便，不需要医学专业人员，易于普及，能够满足大批量样品 快速检测的需求，尤其适用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的测定，对研究肝癌细胞 的生长和破坏机理具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0016] 图1是肝癌血清中含3. 0 mg/L的乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图； 图2是空白血样的激光拉曼光谱图； 图3是实施例1中健康人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图； 图4是实施例2中肝癌早期患者人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图； 图5是实施例3中肝癌晚期患者人体血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光谱图； 图6是乙酰苯丙氨酸标准曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 为了解决现有技术人体血清中病变肝细胞代谢产物乙酰苯丙氨酸含量检测成本 高、耗时长、准确度低、操作复杂，且不能够适应大批量样品快速检测需求的问题，本发明首 次将表面增强激光拉曼光谱检测方法应用到人体血清中乙酰苯丙氨酸的定性、定量检测， 通过采用专用提取试剂高效提取血清样品中乙酰苯丙氨酸，排出其他成分对检测的干扰， 制成样品待测液，经激光拉曼光谱仪扫描，记录其1002cm 1 ± 3cm 1对应峰的强度，能够从 标准曲线上查出样品待测液中对应的乙酰苯丙氨酸含量，进而能够计算得到血清中乙酰苯 丙氨酸含量。
[0018] 下面举例对本发明检测方法作进一步说明。
[0019] 1、乙酰苯丙氨酸标准溶液配制 准确称取乙酰苯丙氨酸标准品10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度 为 L 0 mg/mL 的标准储备溶液，稀释制成 L 0 mg/L、5. 0 mg/L、10. 0 mg/L、20. 0 mg/L、50. 0 mg/L系列浓度标准溶液。
[0020] 2、样品待测液制备 量取血清样品0. 15~0. 25 mL于10 mL离心管中，按三倍体积比加入0. 45~0. 75 mL专用提取试剂，祸旋混勾1.0 min，于0°C~_4°C离心机内离心3. Omin (10000转/分 钟）； 转移上清液于2. OmL具塞试管中，置于-18°C~-25°C冰箱冷冻lOmin，取出于(TC~ -4°C离心机内离心3. Omin (10000转/分钟）； 将所得上清液过〇. 22 μ m~0. 45 μ m有机相尼龙滤膜，所得滤液即为待测液。
[0021] 所用提取试剂的制备方法为：按体积比量取甲醇2. 5~3. 5mL、乙腈1. 5~2. 5mL 和N，N-二甲基甲酰胺0. 5~I. 5mL，混合置于容器内，-18°C~-25°C密闭保存24小时， 用时摇匀。
[0022] 3、设定激光拉曼光谱仪工作条件 激光功率：200mW ; 积分时间：IOsec ; 平均次数：2 ; 平滑参数：1。
[0023] 4、定性测定 取前制的样品待测液0.1 mL，依次加入0.3