一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于维生素的检测领域，具体涉及一种同时检测血液样品中多种脂溶性维 生素的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素是生物生长和代谢所必需的微量营养物质，分为脂溶性和水溶性维生素两 类，缺乏时生物不能正常生长，并导致维生素缺乏症的发生。维生素 A、25 (OH) D2、25 (OH) D3、 E、K1、K2均属于脂溶性维生素，人体缺乏该六种维生素时会表现出不同的症状：维生素 A缺 乏会导致夜盲症、眼部炎症等；维生素 D缺乏会导致儿童佝偻病、成人骨质软化病、老人骨 质疏松症等；维生素 E缺乏会导致新生儿溶血性贫血、神经系统疾病等；维生素 K缺乏会导 致凝血功能障碍、血液凝固时间延长和出血等。
[0003] 在国外，维生素是最主要的营养保健品，维生素对维持人体健康的作用有充分的 科学依据，深入人心。根据统计，维生素在美国保健品市场占有主要份额。随着国际维生素 市场对中国乃至亚洲市场的不断冲击，以及国内科研单位和企业在维生素行业取得的科研 成果和技术突破，我国公民自身的保健意识不断增强。但是，由于缺乏科学的指导，维生素 产品的使用现状很混乱，一些人群为了提高身体各项技能，不惜花重金在保健品上，盲目补 充维生素，补充过量对身体也是一种伤害。如何了解人体是否需要补充所必需的四类脂溶 性维生素，只有通过检测体内各种维生素的真实状态，根据检测结果有针对性的调整需要 的维生素，检测是科学评估和个性化使用维生素唯一的依据。
[0004] 目前，常用的维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液 相色谱法（HPLC)和超高效液相色谱-质谱法（LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体， 也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100%，因此结果差异较大，特异性 较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于检 出限有限，主要用于维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个 组分的同时测定。目前的液相色谱-质谱法只能对一种或两种维生素做定性分析，由于血 浆/血清成分复杂，且维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确 性，所以为了降低检测时的基质效应，使用者都是对不同的维生素逐个检测分析，这样存在 以下的缺点：检测成本较高，而且操作复杂，耗费的时间较长，检测需要的血量较多。目前还 没有一种能够同时检测血清/血浆中多种脂溶性维生素的有效方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种同时检测血液样品中多种脂溶性 维生素的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法，采用LC-MS方法。
[0008] 优选所述血液样品是血浆或血清，更优选为血清。
[0009] 优选所述的多种脂溶性维生素为维生素4、25(0!1)02、25(0!1)034、1(1或1(2中的任 意两种或两种以上。
[0010] 更优选所述的多种脂溶性维生素为维生素4、25(0!1)02、25(0!1)034、1(1和1(2。
[0011] 本发明中LC-MS的条件为：
[0012] 色谱条件：流动相为A :甲醇，B :含甲酸的水；梯度洗脱。
[0013] 质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
[0014] 优选色谱条件：色谱柱：C18 柱（Kinetex C18 50 X 2. 1mm，2. 6 μ m，phenomenex)， 柱温：45°C ;流动相A:甲醇，流动相B :体积分数0.1%甲酸的水；梯度洗脱条件（如表1): 0 ~2min，60% A，2 ~3min，75% A，3 ~3. 5min，98% Α，3· 5 ~4. 0min，98% A，4 ~4. 8min， 60% A，流速(λ 5mL/min，进样量，20 yL。
[0015] 表1梯度洗脱条件
[0016]
[0017] 优选质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气： 60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：5000V，去溶剂温度：550°C。
[0018] MRM质谱参数如表2 :
[0019] 表2 MRM质谱参数
[0020]
[0021] 同时检测血清中六种脂溶性维生素的方法，步骤如下：
[0022] (1)样品处理：向血清样本中加入无水乙醇，再加入正己烷，震荡后离心，取正己 烷层至样品瓶中，吹干，将样品复溶于70 % v/v甲醇水溶液中，0. 2 μ m滤膜过滤，获得待测 样本；所述的血清、无水乙醇、正己烷体积比为1:2:5或1:1. 5:5，血清与70 %甲醇水溶液的 体积比为2:1 ;
[0023] (2)标准工作液的配制：以甲醇配制100 μ g/mL各维生素标准品储备液，然后用 5%m/v BSA(牛血清白蛋白）甲醇溶液制备6个梯度（维生素 A:50、100、200、400、800、 1600ng/mL ;维生素 25(0H)D2、25(0H)D3 :2. 5、10、20、50、100、200ng/mL ;维生素 E :1、5、10、 15、20、25以8/1^;维生素1(1、1(2:0.05、0.1、0.5、1、2、41^/1^)的混合标准溶液分装于1.51^ 棕色瓶中，-20 °C保存备用；
[0024] (3)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电 喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；
[0025] 所述脂溶性维生素为：维生素4、25(0!1)02、25(0!1)03』、1(1和1(2。
[0026] -种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素试剂盒，具有6个梯度（维生素 A : 50、100、200、400、800、1600ng/mL ;维生素 25(0H)D2、25(0H)D3 :2. 5、10、20、50、100、200ng/ mL ;维生素 E :l、5、10、15、20、25yg/mL ;维生素 K1、K2 :0· 05、0· 1、0· 5、l、2、4ng/mL)的混合 标准溶液，无水乙醇，正己烷，70%甲醇水溶液，甲醇，体积分数0.1 %甲酸的水、质控品。
[0027] 所述试剂盒在血清中同时检测维生素 A、25(0H)D2、25(0H)D3、E、Kl和K2中的应 用。
[0028] 应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线 性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中六 种脂溶性的浓度。
[0029] 上述方法中包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工 血清添加混合维生素标准物质制得，并通过检测确定靶值。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种 同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法，特别是同时测定血清中维生素 A、25(0H) D2、25(0H)D3、E、KU K2的方法。采用本发明可以同时检测人血清中六种脂溶性维生素 A、 25 (OH) D2、25 (OH) D3、E、KU K2的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简 单、通量高、结果可靠的检测方法。
[0032] 本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作 简单快捷，可以灵敏的检测出各种维生素的含量，尤其是人体内含量较低的维生素 Κ。
[0033] 维生素 Α、25 (OH) D2、25 (OH) D3、E、KU Κ2是人体内重要的脂溶性维生素，任何一种 维生素的缺乏都会导致相应的疾病。本发明可以同时检测这六种维生素，一是降低了检测 成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以对多种维生素的补充提供依 据。
[0034] 本发明用超高效液相色谱-质谱法检测血清中六种脂溶性维生素，特异性强，灵 敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒不仅可 以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲 目补充维生素的现象发生。
[0035] 本发明的方法针对每种维生素分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种维 生素的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方 法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。
[0036] 本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中的六种脂溶性维生素同时 检测的目的