适用于茶叶中啶虫脒残留的速测方法及相应的试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子化合物的金标免疫分析检测领域，具体涉及一种基于异源竞争 免疫层析法的农药残留金标速测试纸条--适用于茶叶中啶虫脒残留的速测试纸条，该试 纸条适用于茶叶样品中氯化烟碱类农药啶虫脒残留的快速检测。
【背景技术】
[0002] 自美国、欧盟、日本加强对进口食品、农产品检疫检验力度后，我国茶叶出口呈现 大幅下降的趋势，其主要原因是农药超标困扰我国茶叶出口。近两年来，由于啶虫脒等新烟 碱类农药在茶叶上使用频率高，导致啶虫脒等农药残留在茶叶上检出率高、超标率不断上 升。2013年5月，欧盟食品安全局（EFSA)发布的报告指出，新烟碱类农药对授粉昆虫构成 "严重风险"，这类农药与蜜蜂死亡有关，可能影响农作物的授粉，因而啶虫脒作为常用的新 烟碱类农药在茶叶和其他授粉作物上的使用亟需得到有效控制。
[0003] 鉴于茶叶日常检测样品量较大，常规的农药残留检测仪器分析方法（如气相、液 相色谱及其质谱联用）满足不了大量样品在较短时间内完成快速筛查的需求。因此，人们 迫切希望有一种简便、快速、灵敏及价廉的农残检测技术能在野外现场和实验室内进行大 批量的快速筛查试验。迄今，常见的农药残留现场快速筛查方法为酶抑制显色纸片法，但其 检测假阳性比率偏高，受基质干扰大，检测对象局限于有机磷类和氨基甲酸酯类农药，且特 异性不高。近些年来，基于抗原-抗体特异性反应的免疫化学分析法是农药残留快速检测 技术的研究热点之一，其中研究报道最多的是酶联免疫吸附法（ELISA)，已研制出多类农药 ELISA试剂盒，确实有潜在的市场应用前景，但检测需要多步反应，不易于现场操作，仍不能 真正实现现场快速筛查。
[0004] 胶体金标记技术是继同位素、酶、荧光素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技 术。基于胶体金免疫层析技术的试纸条以其使用便捷、价格低廉、筛查结果可视化、环境友 好性等独特优势更受大众欢迎。近些年来，适用于检测小分子化合物的竞争型金标试纸条 研发也越来越多，有关农药方面的公开报道集中在三嗪类、有机磷类、氨基甲酸酯类，而针 对新烟碱类农药金标试纸条的仅涉及吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺单残留或双残留的测定。此 外，一般金标试纸条都是采用同源竞争（免疫半抗原与包被半抗原结构一致）的模式。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、结果可视化、适用于现 场速测的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条（即，基于异源竞 争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条）及相应的检测方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞 争免疫层析金标试纸条（即，基于异源竞争免疫层析法的农药残留金标速测试纸条），该试 纸条包括衬板、样品垫、金标一抗结合垫、硝酸纤维素膜一-NC膜、吸水垫，金标一抗结合垫 包被有胶体金标记的啶虫脒抗体（一抗），所述硝酸纤维素膜一-NC膜上包被有啶虫脒抗原 的检测线---T线和包被有二抗（例如为兔抗鼠 IgG)的质控线 C线。
[0007] 作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的 改进：
[0008] 胶体金标记的啶虫脒抗体（一抗），是由20~40nm (例如为30nm)的纳米金颗粒与 啶虫脒特异性抗体相结合的复合物，抗体与胶体金的结合浓度为4~12mg/L(较佳为5mg/ L);即，每IL胶体金溶液中配用4~12mg(较佳为5mg)抗体。
[0009] 备注说明：胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0. 01% ;
[0010] 包被量为 0· 4 ~0· 6 μ L/mm2 (较佳为 0· 5 μ L/mm2)。
[0011] 作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的 进一步改进：所述啶虫脒抗体为啶虫脒小鼠单抗。
[0012] 作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的 进一步改进：所述检测线上包被的啶虫脒抗原为噻虫啉-OVA卵白蛋白偶联物，即，是指将 噻虫啉半抗原偶联到鸡卵清蛋白（OVA)上的人工抗原，其浓度为500~2000mg/L，所述噻虫 啉半抗原与OVA的偶联比为8:1~15:1 (例如为10:1)。
[0013] 所述质控线包被的二抗为兔抗鼠 IgG，其浓度为50~200mg/L (例如为75mg/L)。 T线和C线的包被量均为0. 04~0. 06 μ L/mm (较佳为0. 05 μ L/mm)。
[0014] 作为本发明的适用于茶叶中啶虫脒残留检测的异源竞争免疫层析金标试纸条的 进一步改进：
[0015] 所述检测线和质控线所用的稀释液是质量浓度1~5%蔗糖的0.0 lM PBS溶液 (PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液）。
[0016] 本发明还同时提供了利用上述试纸条进行的茶叶鲜叶和/或成品茶中啶虫脒残 留的快速检测方法：
[0017] 以茶叶鲜叶、成品茶作为待测样品；
[0018] 直接用开水冲泡待测样品30~60分钟，得茶汤；或者，先将待测样品研磨成粉状 后，加入开水冲泡30~60分钟，得茶汤；
[0019] 取茶汤滴加 2~3滴到样品垫的点样区（该点样区位于样品垫的中间位置）中进 行层析反应，5~10分钟后根据检测线和质控线的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性 结果；
[0020] 质控线---C线显红色表示试纸条有效，未显色则失效；
[0021] 检测线---T线显红色则判断为阴性，表示茶汤中未检测到啶虫脒残留，或茶汤中 啶虫脒残留浓度低于0. 〇lmg/L ;
[0022] 检测线---T线未显色则判断为阳性，表示茶汤中啶虫脒浓度高于（彡）0.01mg/L。
[0023] 备注说明：粉红色即显色不完全，表示偏阳性，显示浅红色代表检测到啶虫脒农药 的浓度低于不显色的情况。
[0024] 作为本发明的茶叶鲜叶和成品茶中啶虫脒残留的快速检测方法的改进：
[0025] 所述成品茶包括：绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶、黑茶。
[0026] 在本发明中，采用质量浓度1%蔗糖的0· OlM PBS溶液（PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液） 作为稀释液可以保护包被抗原和包被二抗，从而延长抗原和二抗的活性。
[0027] 本发明的判断方式具体如下：
[0028] 当质控线一C线和检测线一T线均显示红色，表示待测样品为阴性；
[0029] 质控线---C线显示红色，检测线一T线显示浅红色，表示待测样品为偏阳性；
[0030] 质控线一C线显示红色，检测线一T线不显色，表示待测样品为阳性；
[0031] 质控线一C线不显色，无论检测线一T线为什么状态，均表示待测样品的检测为 失效。
[0032] 备注说明：阴性代表待测样品中不含有啶虫脒，阳性代表待测样品中含有啶虫脒； 相对而言，"检测线---T线不显色"比"T线显示浅红色"代表该待测样品中脒残留的浓度 尚。
[0033] 通过本发明的判定方法可以对茶叶样品中啶虫脒残留的进行快速定性与定量筛 选甄别，本试纸条的检测灵敏度高、使用方便快捷、结果准确。
[0034] 在本发明的试纸条的制备方法中，确定了单个试纸条的最终宽度控制在2. 5~ 3. 5mm ;所述胶体金垫（金标一抗结合垫）的材料为亲水玻璃纤维膜（厚度约为0· 35~ 0. 55mm);所述样品垫为亲水玻璃纤维膜（厚度约为0. 35~0. 55mm);所述吸水垫的材料为 吸水滤纸（厚度约为〇· 75~I. 05mm)。
[0035] 本发明的有益效果：本试纸条采用胶体金标记啶虫脒一抗作为免疫金标探针，可 以快速检测茶叶鲜叶和成品茶中氯化烟碱类农药啶虫脒的残留量，是一种快速、简便、准 确、低成本的农药残留检测新手段。本发明中采用的啶虫脒抗体对啶虫脒的亲和性高，这有 利于提高竞争式免疫层析法的灵敏度，肉眼判断检出限可达到〇. 〇lmg/L。
[0036] 本发明的发明点在于啶虫脒金标速测试纸条还未见公开报道，采用的检测技术首 次公开。与现有的仪器检测方法相比，本发明的试纸条实现了啶虫脒残留的快速检测，具有 灵敏度高、特异性