基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法。
【背景技术】
[0002]防止微生物引起的食品腐败和食源性疾病是食品安全的重要课题也是食品加工和保藏的关键环节。在过去的20年间，全球食源性感染率出现显著增长，沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)和单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)已成为世界范围内最主要的三种食源性致病菌。单增李斯特菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性短杆菌，存在于土壤、污水、植物、人畜粪便和污染的食品中。该菌可以在很广的温度范围内生长，对PH值、盐浓度、冷冻和干燥条件也有一定程度的耐受性。单增李斯特菌可以存在于多种未经加工和加工过的食品中，容易污染的食品类型包括鱼和海产品(19.4%)，生香肠(6.3%)，奶酪(5.5% )，加工的肉制品(4.5%)等。该菌主要是通过污染的食品进入人畜体内，对孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下的人威胁较大。
[0003]目前单增李斯特菌的国标检测方法周期长，精度低，检测步骤也较为复杂，不太适于食品卫生的常规快速检验。分子生物学方法由于荧光标记种类和仪器检测通道限制等原因，不适合大量致病菌检测的需要。胶体金检测方法基于抗原抗体反应的免疫学原理，以胶体金作为示踪标志物进行标记，操作简单，时间短，可在同一时间内检测大量样品。利用胶体金试纸对单增李斯特菌进行快速检测，可以作为常规方法的有益补充，用于现场样品的初筛。
【发明内容】
[0004]针对上述存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法，用于快速简便地检测样品中的单增李斯特菌。采用双抗原夹心法将针对单增李斯特菌的特异性抗体蛋白包被于NC膜的检测线上，用胶体金标记另一种单增李斯特菌抗体蛋白，用以检测样品中的单增李斯特菌。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法，该检测方法所使用器材包括有PVC板、样品垫、包被有李斯特菌菌体蛋白抗体的胶体金垫、带有检测线和质控线的NC膜、吸水垫；检测方法包括以下步骤:
[0006]I)胶体金溶液的制备
[0007]将0.01 %氯金酸水溶液25mL加入到三角瓶中，置于磁力搅拌器上加热至沸腾稳定后，加入还原剂柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热直至溶液颜色变为透明红色，冷却后加去离子水补充至原体积，制备获得的胶体金溶液用于单增李斯特菌菌体蛋白抗体的标记。
[0008]2)胶体金探针的制备
[0009]将上述胶体金溶液的pH值调整至8.0-9.0，向其中逐滴加入单增李斯特菌菌体蛋白抗体，至终浓度在10-30 μ g/mL，缓慢摇匀；加入1% -2%的牛血清白蛋白，继续混合均匀；通过差速离心，收集抗体-胶体金标记物，将纯化后的抗体-胶体金标记物用磷酸盐缓冲液溶解，制备获得的胶体金探针置温度为4°C保存。
[0010]3)试纸条的制备和组装
[0011]将纯化后的胶体金探针涂布在玻璃纤维膜上，干燥后备用；将带有检测线和质控线的NC膜用含有1%-2%的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液处理后备用；将单增李斯特菌菌体蛋白抗体包被在NC膜上，作为检测线；将羊抗兔IgG蛋白包被在NC膜上，作为质控线，干燥后备用；组装时，在PVC板上粘贴NC膜；在带有检测线和质控线的NC膜两端分别放置吸水垫和胶体金垫，吸水垫和胶体金垫均与NC膜部分重叠；紧邻包被有单增李斯特菌菌体蛋白抗体的胶体金垫粘贴样品垫，样品垫与胶体金垫部分重叠；组装后，获得检测用试纸条。
[0012]4)检测程序和结果判定
[0013]试纸条平放，将被测样品滴加到试纸条的样品垫上，5-10min内观察结果，如果检测线和质控线均出现红线，则为阳性结果；如果检测线未出现红线，质控线出现红线，则为阴性结果；如果检测线和质控线均未出现红色，则检测结果无效。
[0014]本发明的效果是:在胶体金垫上结合一种单增李斯特菌菌体蛋白抗体作为捕捉抗体，在NC膜检测线上包被另一种单增李斯特菌菌体蛋白抗体作为检测抗体，用抗标记抗体的多抗包被质控线作为质控抗体。本发明避免了在胶体金垫和检测线上使用相同蛋白所可能造成的假阳性的出现。应用双抗夹心法的原理检测样品中的单增李斯特菌，减少交叉反应的发生，增强特异性，操作简便，5-10min内观察结果，可实现现场样本快速检测。此外，单增李斯特菌菌体蛋白抗体可通过实验室制备或购买商业化产品；与单克隆抗体相比，省去了杂交瘤细胞的融合和筛选过程，减少了制备周期和成本。与ELISA或PCR方法相比，利用试纸条检测时无需使用仪器设备，便于操作。
【附图说明】
[0015]图1为本发明试纸条结构示意图；
[0016]图2为本发明实施例中单增李斯特菌胶体金检测试纸条的模拟带菌检测结果。
[0017]图中:
[0018]1、PVC板 2、样品垫3、胶体金垫 4、检测线
[0019]5、质控线 6、NC膜 7、吸水垫
【具体实施方式】
[0020]结合附图对本发明的基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法进一步说明。
[0021]本发明的基于胶体金试纸条的单增李斯特菌检测方法，该检测方法所使用器材包括有PVC板、样品垫、包被有李斯特菌菌体蛋白抗体的胶体金垫、带有检测线和质控线的NC膜、吸水垫；检测方法包括以下步骤:
[0022]I)胶体金溶液的制备
[0023]将0.01%氯金酸水溶液25mL加入到三角瓶中，置于磁力搅拌器上加热至沸腾稳定后，加入还原剂柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热直至溶液颜色变为透明红色，冷却后加去离子水补充至原体积，制备获得的胶体金溶液用于单增李斯特菌菌体蛋白抗体的标记。
[0024]2)胶体金探针的制备
[0025]将上述胶体金溶液的pH值调整至8.0-9.0，向其中逐滴加入单增李斯特菌菌体蛋白抗体，至终浓度在10-30 μ g/mL,缓慢摇匀；加入1% -2%的牛血清白蛋白，继续混合均匀；通过差速离心，收集抗体-胶体金标记物，将纯化后的抗体-胶体金标记物用磷酸盐缓冲液溶解，制备获得的胶体金探针置温度为4°C保存。
[0026]3)试纸条的制备和组装
[0027]将纯化后的胶体金探针涂布在玻璃纤维膜上，干燥后备用；将带有检测线和质控线的NC膜用含有1%-2%的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液处理后备用；将单增李斯特菌菌体蛋白抗体包被在NC膜上，作为检测线；将羊抗兔IgG蛋白包被在NC膜上，作为质控线，干燥后备用；组装时，在PVC板上粘贴NC膜；在带有检测线和质控线的NC膜两端分别放置吸水垫和胶体金垫，吸水垫和胶体金垫均与NC膜部分重叠；紧邻包被有单增李斯特菌菌体蛋白抗体的胶体金垫粘贴样品垫，样品垫与胶体金垫部分重叠