一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，能够在很短时间内实现对生物样品中降钙素原的定量检测，具有操作简单，灵敏度高，低成本等特点。
技术背景
[0002]降I丐素原(procalcitonin，PCT)是一个小分子蛋白，含有116个氨基酸残基，分子量为大约13kDa。PCT的氨基酸序列首次在1984年被Moullec等人发现。它属于一类相关蛋白的家族(CAPA肽家族)，包括降钙素基因相关肽I和I1、淀粉不溶素、肾上腺髓质素和降钙素。类似于CAPA家族的其他肽，PCT来源于一个前体分子-降钙素原前体。降钙素原前体含有141个氨基酸，其N端去除25个氨基酸残基后得到降钙素原。
[0003]1993年，有报道发现PCT水平在细菌系统感染患者中有所升高。如今PCT已经成为伴随有全身性炎症和败血症疾病的主标记物。PCT在临床诊断中的价值，主要是基于PCT浓度和炎症严重程度的紧密相关。PCT在正常人血中浓度低于0.05ng/ml，当血清中PCT浓度高于0.5ng/ml时出现重症败血症和/或败血症休克的风险较低；血清PCT浓度彡2ng/mL出现重症败血症和/或败血症休克的风险较高，在脓毒血症、败血症患者其浓度显著增高，可达1000ng/ml，是正常人的2000倍。PCT可在感染后2个小时后检测到，对临床早期诊断具有重要意义，且在感染后12-24小时达到高峰，体内、外稳定性好。
[0004]PCT作为一种具有创新意义的严重细菌性感染等疾病的实验指标，提高了临床诊断的准确性。因此，PCT的诊断价值非常之高，使用单克隆抗体定量检测患者血液中PCT的重要性更是显而易见。
[0005]目前，用于PCT检测的方法主要有酶联免疫法，免疫比浊法，胶体金免疫层析，免疫荧光法等，这些方法在一定程度上能够实现对PCT的检测，但是还存在操作复杂，灵敏度低，检测成本高等不足。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨焚光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。中国专利(CN102359958 A)公开了一种检测降钙素原的试剂盒，采用酶促化学发光法实现对降钙素原的定量检测，本方法相比其他传统方法提高了检测的灵敏度和准确性，但需要对检测样品进行复杂的预处理，需要借助大型化学发光检测仪，同时所需试剂消耗量大，检测时间长。
[0006]近年来，生物分析技术领域得到了快速的发展，出现了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技术是其中最活跃的一支，在科研和实际应用领域都获得了广泛的重视。微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用，尤其是在免疫分析领域已崭露头角。
[0007]表面功能化的磁性微球作为固相载体，可以用来有效地捕获核酸、蛋白分子、病毒颗粒甚至细胞，已经被广泛地应用于各种生化指标的临床诊断等领域。而微流控芯片系统具有快速、高效、集成化等特点，两者相结合，将成为一种新型的高性能检测方法，以解决当前检测方法中存在的灵敏度低，检测过程复杂，难以实现微量样本检测的问题，有望进一步推动临床检测仪器向便携化和微型化发展。
[0008]免疫磁珠的生物微流控芯片是将磁颗粒技术，免疫分析集成到微流控芯片上的一种分析检测方法，目前这种综合性的检测方法的主要难点表现为:1)液体在芯片内部微流动的智能控制，目前常采用的方法是在芯片内部设置多个微栗和微阀，使得微流控体系变得更加复杂化；2)反应体系的混合不充分，导致反应不充分；3)集成化程度不高，导致非特异性背景高。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是为解决现有技术的不足，提出一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，临床检验人员只需经过简单操作，即可在15分钟内快速实现样品中降钙素原浓度的定量检测。检测结果灵敏度高，准确可靠，重复性好，交叉污染率低。
[0010]本发明的技术问题所采用的技术方案如下为:
[0011]—种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，所述微流控芯片结构主要包括盖片⑴和底片(11)，其中盖片⑴上的空气栗(3)，气流微通道(5)，加样口⑵、样本液流通道出)、第一生物标记物存储池(4)、微混合器(7)以及过渡区(10)依次连接；底片(11)上的过滤器(12)，反应池(13)，清洗池(14)，检测池(15)，溶液释放通道(18)依次连接；检测池(15)通过溶液释放通道(18)与清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)连接；第一生物标记物存储池(4)存储预封装酶或发光剂标记的抗降钙素原抗体溶液；反应池(13)存储预封装磁颗粒标记的抗降钙素原抗体；所述清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)存储预封装清洗液和发光基底液；盖片(I)过渡区(10)和底片(11)过滤器(12)连接；所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；过滤器(12)由腔体和滤血膜组成；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。
[0012]具体地，所述第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)为液囊或腔体，体积为10?500 μ I，进一步优选10?300 μ I。
[0013]具体地，所述微流控芯片的微混合器是宽度为20?300 μ m，深度为10?100 μ m的蛇形，折线形或方形结构。
[0014]优选地，微混合器为宽150 μ m，深度为50 μ m的方形结构，在外部压力作用下，可使样本和试剂充分混合，提高反应效率。
[0015]具体地，所述微流控芯片的反应池为毛细管微通道，该毛细管微通道为管状通道或矩形通道，允许微液体流进或通过。
[0016]具体地，所述微流控芯片的反应池为管状通道，直径为0.5?10mm，作为优选微通道的直径为5mm，进一步优选2mm或Imm0
[0017]具体地，所述微流控芯片的毛细管微通道为矩形通道时尺寸范围:宽为0.1?5臟，深度为0.01?2臟，长为5?40mm η
[0018]优选地，所述微流控芯片的毛细管微通道为矩形通道时尺寸范围:宽为0.3?2謹，深度为0.2?I謹，长为5?2Ctam。
[0019]具体地，所述微流控芯片的过滤器主要包括具有一定形状的腔体和滤血膜，所述腔体体积为样本体积的3?10倍，优选腔体体积为样本体积的4?6倍。
[0020]具体地，所述微流控芯片底片中过滤器内的滤血膜材质可以为玻璃纤维膜，聚酯纤维膜或CytoSep膜等。
[0021]优选地，以玻璃纤维膜作为滤血膜。
[0022]具体地，本发明所述微流控芯片的过滤器具有滤除样本杂质的功能外，还可以将液体引导进入下一级微结构和微通道。
[0023]本发明所述毛细管通道的体积小于150 μ 1，作为优选，毛细管通道的体积小于100 μ I，进一步优选，毛细管通道体积小于50 μ I。
[0024]具体地，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强剂，可混合后注入同一个发光液存储池，或分别注入两个不同的发光液存储池；
[0025]具体地，所述磁颗粒标记的抗降钙素原抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，为顺磁性的Fe3O4或γ -Fe 203化合物，磁颗粒粒径为0.1?10 μ m。优选Fe 304化合物，且磁颗粒粒径为I?3 μ m，更优选粒径为2.0 μ m的磁颗粒。
[0026]具体地，本发明所述微流控芯片，各功能区之间通过微通道和微结构进行衔接，内部形成一个完整的液流和气流系统。
[0027]具体地，本发明所述微流控芯片盖片和底片内的微通道和微结构的加工工艺包括模塑法、热压法、激光刻蚀法和软光刻法等，本发明的实施例中优选模塑法来制作微流控芯片。
[0028]本发明所述微流控芯片的盖片和底片材料可为聚酰胺(PI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环氧树脂，聚丙烯(PP)和ABS树脂等，优选环氧树脂和ABS树脂，进一步优选环氧树脂。
[0029]具体地，本发明所述微流控芯片盖片和底片内除上述主要微通道和微结构外还有许多透气孔用于消除液体流动过程中产生的气泡，以及用于组装固定的让位孔和立柱。
[0030]具体地，所述微流控芯片盖片上的空气栗(3)主要是通过气流通道(5)传递压力，主要作用是用于样本和第一生物标记物的混合，提高一级孵育效果。
[0031]具体地，所述微流控芯片的气流通道尺寸为0.1?100 μπι，进一步优选2?50 μ mD
[0032]具体地，所述微流控芯片盖片的过渡区是盖片和底片连接的枢纽，一级反应混合物经过渡区流入过滤器，实现了液体在微流控芯片的上下片层间的流动。
[0033]本发明所述微流控芯片的反应池内部需进行一定的表面改性处理，所述表面改性处理方法可为化学反应，表面涂层，等离子处理等，从而获得良好的亲水性，促使液体样本在毛细管作用下流动，快速填充微通道。
[0034]本发明中所述酶，包含但不限定于过氧化氢酶(HRP)和碱