一种活化部分凝血活酶时间测定试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种凝血试剂及其制备方法，特别涉及一种活化部分凝血活酶时间测 定试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 活化部分凝血活酶时间（APTT)可用于判断内源性凝血活性状态，是临床上主要 的凝血性能测试指标之一。活化部分凝血活酶时间测定试剂的主要组份为活化剂和磷脂， 磷脂是含有磷酸的脂类，属于复合脂。作为血小板替代物，磷脂参与内源性凝血途径。作 为活化部分凝血活酶时间测定试剂的主要组份之一，磷脂富含不饱和脂肪酸，易被氧化从 而产生一系列过氧化脂质，从而影响了其生理活性。以磷脂酰胆碱为例，其分子中含有甘 油、脂肪酸、磷酸及胆碱等基团。同时，其分子中不同碳位上所接的脂肪酸不同：a碳位 (RiCO -）上接的几乎都是饱和脂肪酸，而0碳位（R2C0 -）上接的一般为油酸、亚油酸、 亚麻酸及花生四烯酸等不饱和脂肪酸。在化学性质上，主要表现在脂键、脂肪酸和磷脂的X 基（CH 2CH2N(CH3)3)上，可发生包括氧化、羟基化等反应。特别地，其中的不饱和脂肪酸易于 氧化发生自发的氧化反应，生成过氧化产物，从而影响了磷脂的性能。
[0003] 为了避免APTT测定试剂中的磷脂氧化，同时也为了制备稳定性较好的APTT测定 试剂，包括避免试剂中微生物和细菌的繁衍，丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚和叠氮酸钠成 为APTT测定试剂稳定剂的主要选择，这方面可查询到的专利文献很多，包括早期的专利文 献US4455377和US5091304。在这些常用的稳定剂当中，丁基羟基甲苯具有一定的毒性， 毒性相对较小，而叠氮酸钠的毒性较大，与铜管等接触易于引爆，因此，增添了生产过程中 原料的使用和控制难度。另外，除了加入丁基羟基甲苯或丁基羟基茴香醚、叠氮酸钠以外， 为了进一步提升活化部分凝血酶测定试剂的稳定性，在试剂中加入多糖或多醇类聚合物 (JP2994557B2, JP3330685B2)，这类物质的加入，可提高APTT所含组成尤其是活化剂的分 散性和均匀性，或作为一种助悬剂，提高溶液的粘度，使胶体颗粒能够长期悬浮在溶液中不 会沉降，然而，这类高分子化合物的加入，在提升混合液粘度的同时，也会降低采用光学法 测定的APTT值的准确度。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有APTT测定试剂中稳定剂的不足，提出一种新型的APTT测定试剂， 生产安全性更高、稳定性效果更强、检测准确度更高。
[0005] 本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种APTT测定试剂，组分包括：磷脂、活化剂及稳定剂，所述的稳定剂包括丙氨酸 和儿茶酸，所述丙氨酸的加入量为质量体积比1-4%，所述儿茶酸的加入量为0. 5-5mM。
[0007] 进一步地，上述APTT测定试剂中还包括其它稳定剂，包括：氯化钠、丁基羟基甲 苯、抗坏血酸、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
[0008] 进一步地，上述APTT测定试剂中各组分的含量为：磷脂0. 002-0. 05 %、活化剂 0. 002-0. 08%、丙氨酸1-4%、儿茶酸0. 5-5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0009] 优选地，上述APTT测定试剂中各组分的含量为：磷脂0. 04%，活化剂0. 05%，丙氨 酸2. 5%，儿茶酸1. 5mM，其中的百分比均为质量体积百分比。
[0010]上述其它稳定剂的加入量为：氯化钠0. 5-3%、丁基羟基甲苯0. 01-0. 1%、抗坏血 酸0. 05-0. 5%、聚乙二醇0. 01-0. 5%、甘露醇1-4%、麦芽糖1-3%，其中的百分比均为质量 体积百分比。
[0011] 优选地，上述其它稳定剂的加入量为：氯化钠1.5%，丁基羟基甲苯0.04%、抗坏 血酸0. 2%、聚乙二醇0. 05 %、甘露醇2 %、麦芽糖的加入量为1. 5%，其中的百分比均为质 量体积百分比。
[0012] 所述活化剂为纳米二氧化硅。
[0013] 所述磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少两 种，并至少包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
[0014] 上述APTT测定试剂中还可加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，加入量为25-75mM。
[0015] 上述APTT测定试剂中还可加入调节APTT值的二价金属离子的氯化物，包括氯化 镁、氯化钙等。
[0016] 上述APTT测定试剂的制备过程包括：制备羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，调节缓冲 液pH值至中性，并加入氯化钠；向上述缓冲液中加入活化剂，经搅拌混匀后，加入磷脂及其 它组分，经混匀搅拌并过滤后，即得到APTT测定试剂。氯化钠早于其它组分加入，一方面起 到溶液离子强度调节剂的作用，另一方面起到稳定剂的作用。
[0017]与现有的APTT测定试剂相比，本发明试剂有如下优点：（1)采用儿茶酸作为抗氧 化剂，儿茶酸中含有邻苯二酚结构，邻苯二酚结构具有很强的金属离子蛰合能力，从而降低 了金属离子对氧化反应的催化作用；特别地，在中性条件下，儿茶酸中的酚羟基极易与金属 离子螯合，从而阻止金属离子对自由基连锁反应的催化作用。儿茶酸中的邻苯二酚结构能 够与过氧自由基发生反应，从而终止脂质过氧化链反应，从而进一步提升了试剂的稳定性 能。（2)在制备凝血试剂的过程中，所用原料中的少量重金属离子，会导致APTT测定试剂不 稳定，儿茶酸与其它抗氧化剂共同使用时可以增强对金属离子的螯合效果，比如儿茶酸可 与丙氨酸一起，起到类似H)TA钠盐或钾盐对金属离子的螯合作用。（3)剔除了一般稳定剂 中毒性较大的组份，选用儿茶酸替代常用的叠氮酸钠，APTT测定试剂的生产和使用过程更 安全。（4)去掉叠氮酸钠后，用以提升试剂稳定性的多糖或多醇类聚合物用量减少甚至完全 不用，大大提高了采用光学法测定的APTT值的准确度。（5)在一般稳定剂的基础上，配合丙 氨酸和儿茶酸共同作用，APTT测定试剂的稳定性也更高。
【附图说明】
[0018] 图1 37°C条件下儿茶酸的加入量对APTT测定试剂稳定性的影响。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0020] 实施例1
[0021] 称取1.5g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至 500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7. 3,加入15g氯化钠、0. 2g纳米二氧化 硅。经搅拌混匀后，加入0. 3g混合磷脂（0.lg磷脂酰丝氨酸和0. 2g磷脂酰甘油），经充分 混合均勾后，加入0. 4g丁基羟基甲苯、0. 5g聚乙二醇和0. 5g叠氮酸钠，定容至1L。搅拌混 匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
[0022] 实施例2
[0023] 称取1. 5g羟乙基哌嗪乙硫磺酸，加入体积为1. 5L的玻璃瓶中，加去离子水至 500mL，搅拌溶解，用稀氢氧化钠溶液调节至pH为7. 3,加入15g氯化钠、0. 2g纳米二氧化 硅。经搅拌混匀后，加入0. 3g混合磷脂（0.lg磷脂酰丝氨酸和0. 2g磷脂酰甘油），经充分混 合均勾后，加入0. 4g丁基羟基甲苯、0. 5g聚乙二醇、12g丙氨酸、1. 5mM儿茶酸，定容至1L。 搅拌混匀并过滤后，滤液即为液态APTT测定试剂。
[0024] 实施例1和实施例2的配制组成基本相同，只是在实施例2中，取代实施例1中加 入的叠氮酸钠，而改为相应的丙氨酸和儿茶酸。
[0025] 将实施例1和实施例2配制的APTT测定试剂，结合25mM的氯化钙，用CA1500全 自动血