猪瘟病毒e2蛋白定量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测方法的改进与研发技术领域，特别是涉及一种猪瘟病毒E2 蛋白定量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前猪瘟病毒E2蛋白定量的方法有凝胶成像软件分析法和高效液相色谱法。凝 胶成像软件分析法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)和Western-blot进行猪瘟病毒E2 蛋白的定量和定性分析，耗时较长；高效液相色谱法可快速进行猪瘟病毒E2蛋白的定量， 但对仪器设备和操作人员要求较高，且不能进行免疫学分析（定性）；而应用单克隆抗体进 行猪瘟病毒E2蛋白的定量定性分析，是基于BCA蛋白定量法的原理，BCA蛋白定量法测定 的是样品中的总蛋白量；将单克隆抗体包被于反应板内捕获猪瘟病毒E2蛋白，通过显色定 量精确且步骤简单、省时、易于操作。
[0003] 文献检索披露：猪瘟病毒E2蛋白定量的S0P和相关专利，凝胶成像软件分析 法以牛血清白蛋白（BSA)为标准品与待检猪瘟病毒E2蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和Western-blot分析，经染色、脱色、拍照后，结合Western-blot的目的条带， 以BSA建立标准曲线，根据猪瘟病毒E2蛋白的灰度值进行定量；高效液相色谱法以纯化的 猪瘟病毒E2蛋白为标准品，建立标准曲线，可对表达的猪瘟病毒E2蛋白进行定量精确，但 对设备和操作人员专业水平要求较高，且需通过Western-blot法进行目的蛋白的定性。目 前，国内尚无机构和学者应用单克隆抗体捕获猪瘟病毒E2蛋白再结合BCA法进行定量定性 分析，本方法步骤简单、省时、易于操作。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于：研制一种猪瘟病毒E2蛋白定量定性的新方法，在不改变定量 精确度的前提下，本方法步骤简单、省时、易于操作，为今后猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活 疫苗的生产检验提供技术支持。
[0005] 本发明的技术方案如下：猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，该检测方法包括下述 步骤： 一、 对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及纯化步骤； 二、 针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓度的 优化步骤； 三、 临界值的确定及检测结果的确定步骤。步骤一的具体方法：①将制备单克隆抗体 的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后的健康细胞离心并调整到1.0Xl〇6/ml; ②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③ 用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用MelonGelIgGSpinPurificationKit进一步纯化； ④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定量后备用。步骤二的具体方法：①用 包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、 12. 5μg/ml、6. 25μg/ml、3. 125μg/ml、L56μg/ml，每个稀释度8孔；②将包被板内每孔 加入50μ1上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4°C，在潮汐式振荡器上振荡16小时； ④弃去板内的液体，每孔加300μ1PBST，振荡洗涤5min，重复洗3次；⑤弃去PBST后每孔 加入由PBS+1 %BSA制备的100μ1PBA置37°C，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步 骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ ml、12. 5μg/ml、6. 25μg/ml、3. 125μg/ml、l. 56μg/ml，同时设以PBST为阴性对照的孔， 加入上述制备好的包被板内，50μ1/孔，置37°C反应1小时；⑦每孔加入200μ1的BCA试剂 盒中的显色液，置37°C反应30min;⑧用酶标仪在562nm进行读数，计算Ρ/Ν值；⑨当单克隆 抗体浓度3. 125μg/ml进行包被时P/N值最大，确定为最佳单抗包被浓度；当猪瘟病毒E2 蛋白标准品浓度在6. 25~100μg/ml时绘制的标准曲线具有良好的线性关系，R2> 98 %， 最终确定检测的样本每孔加入50μ1即可保证样品检测结果的精确性。步骤三的具体方 法：随机抽取20份猪瘟病毒Ε2重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的猪瘟病毒Ε2蛋白，按上 述步骤二的方法检测，计算20份猪瘟病毒Ε2蛋白的平均OD值（X)和标准差SD，阴阳性临 界值=X+3SD，当待检样本OD值多X+3SD时，可在99. 9%的水平上判定为阳性。
[0006] 本发明的有益效果：将纯化后特定量的单克隆抗体包被于反应板内，倍比稀释加 入纯化并精确定量的猪瘟病毒Ε2标准品和猪瘟病毒Ε2蛋白（未纯化细胞表达的上清）， 置37°C反应60min，用PBST(PBS+0. 02%吐温20)洗6次，每次300μ1 ;每个样品孔内加入 200μ1BCA试剂盒中的BCA工作液，置37°C反应30min，用酶标仪在562nm进行测定，根据标 准曲线计算出样品的蛋白浓度。与常规方法相比，此方法的定量定性过程约2小时，在不影 响定量结果的前提下，对人员和仪器设备要求不高，省时省力，为猪瘟病毒E2蛋白定量提 供了新的方法。
【附图说明】
[0007] 下面结合附图对发明作进一步的说明，附图1为单抗法标准曲线，附图2为高效液 相色谱法标准曲线。
【具体实施方式】
[0008] 下面将结合实施例对发明作进一步说明。
[0009] 实施例1、猪瘟病毒E2蛋白定量的检测方法，一、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗 体的制备及纯化：①将制备单克隆抗体的杂交瘤细胞按常规的培养方式进行培养，培养后 的健康细胞离心并调整到1. 〇Xl〇6/ml;②密度调整后的杂交瘤细胞注射到Bacb/c小鼠腹 腔内，14天后抽取小鼠腹腔内的腹水；③用饱和硫酸铵进行初步纯化后，用MelonGelIgG SpinPurificationKit进一步纯化；④用BCA试剂盒对纯化后的单克隆抗体进行定量，定 量后备用。
[0010] 二、针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的包被、包被浓度、待检猪瘟病毒E2蛋白浓 度的优化：①用包被buffer倍比稀释纯化后的单克隆抗体，浓度分别为100μg/ml、50μg/ ml、25μg/ml、12. 5μg/ml、6· 25μg/ml、3· 125μg/ml、1· 56μg/ml，每个稀释度 8 孔；②将 包被板内每孔加入50μ1上述稀释后的单克隆抗体；③将包被板置4°C，在潮汐式振荡器上 振荡16小时；④弃去板内的液体，每孔加300μ1PBST，振荡洗涤5min，重复洗3次。⑤弃 去PBST后每孔加入100μ1PBA(PBS+1%BSA)置37°C，在潮汐式振荡器上振荡2小时，重复上述步骤3次；⑥纯化的猪瘟病毒E2蛋白标准品分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg