丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测技术，具体地说是丹酰肼及其衍生物在糖 蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍 的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这 些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化 对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附 等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但 目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也 占到较1?的比例。
[0003] 分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤，是下一步结构分析得以实施的基础。 目前凝胶上蛋白质染色主要分为预染及后染两类。前者在电泳前对样品进行处理，使染料 特异性地与样品内糖蛋白相结合，经电泳分离之后即可在相应激发波长下进行观察，后染 主要对电泳后的蛋白凝胶进行特异性染色。
[0004] 目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于后染，且多数产品均以高附加值的价格在 市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进 行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。糖蛋白特异性荧光预染检 测技术鲜有报道。本发明开发的丹酰肼及其衍生物荧光预染检测方法灵敏度接近Pr 0-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光预染检测技术，有较好的基础与 临床意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测中的应 用。
[0006] 本发明所述的丹酰肼相关化合物是指以丹酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐 等。
[0007] 丹酰肼母核为：
[0008]
[0009] 为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用丹酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染 检测的方法包括如下步骤：
[0010] 1)在l-20yL含0.5-10yg蛋白样品（不足l-20yL用重蒸水补足）中加入 0. 005-0. 05M高碘酸水溶液1-20 μ L，置于避光处进行氧化反应5-30min ;优选的样品体积 为10 μ L，优选的高碘酸摩尔浓为0. 03M，体积为10 μ L，优选的反应时间是IOmin ;
[0011] 2)在反应液中加入0. 1-0. 3Μ抗坏血酸l-ΙΟμ L，摇匀反应0. 5-5min ;优选的抗坏 血酸摩尔浓度是〇. 24M，体积为5 μ L，优选的反应时间是Imin ;
[0012] 3)在反应液中加入丹酰肼或其衍生物按重量体积比1-5%二甲基亚砜溶液 1-5 μ L，37°C环境下反应10_50min ;优选的丹酰肼或其衍生物溶液为含重量体积是2%，体 积为2. 5 μ L，优选的反应时间是30min ;
[0013] 4)在反应液中加入10-50 μ L3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；优选的体积为30 μ L ;
[0014] 5)电泳，观察。
[0015] 前期研究表明该技术有如下优点：
[0016] 1)灵敏度高：丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法灵敏度同Pr0-Q Emerald488 灵敏度相当；
[0017] 2)操作简单迅速：省去后染必需的固定等操作步骤，可在40min内完成；电泳结束 后即可观察；
[0018] 3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
[0019] 4)可逆性好：容易脱色；
[0020] 5)质谱兼容性好：由于丹酰肼荧光预染检测法不影响蛋白质结构，所以可与 MALDI-T0F等质谱仪高度兼容；
[0021] 6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
[0022] 7)成本低。
【附图说明】
[0023] 图1.丹酰肼的化学结构；
[0024] 图2中（A-D)为在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋 白质样品选择性及灵敏度比较。（A)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，（B)丹酰肼糖蛋白荧 光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白荧 光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。 带 1，1000 ng ;带 2,500ng ;带 3,250ng ;带 4,125ng ;带 5,64ng ;带 6,32ng ;带 7,16ng ;带 8， 8ng;带9,4ng;带10, 2ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染 色法均按照文献记载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。
[0025] (E-H)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏度比 较。（E)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，（F)丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白突光染色法检测，（G)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（H)Pro-Q Emerald糖 蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。带l，5000ng;带2,2500ng;带 3,1250ng ;带 4,625ng ;带 5, 320ng ;带 6,160ng ;带 7,80ng ;带 8,40ng ;带 9, 20ng ;带 10, 10ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染色法均按照文献记载 操作。
[0026] 图3.二向SDS-PAGE胶上，㈧丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，⑶丹酰肼糖蛋白 荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白 荧光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检 测。分离样品为人血清总蛋白；IPG胶条长13厘米，pH4-7 ;分离胶的浓度为11. 4% ;样品 上样量为25 μ g/胶条。
[0027] 图4.比较在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性，样品为用 PNGase F去除N-链糖后的人血清总蛋白。带TP，人血清总蛋白；带DP，去N-链糖后人血 清总蛋白；Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预 染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-Q Emerald糖蛋白 荧光染色法，Pro-Q+SR组为Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧 光染色法检测。
[0028] 图5.在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对富集后糖基化蛋白选择性比较，样品为使 用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白。带TP，未富集的人血清总蛋白； 带Con A Enriched Glycoproteins,使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖 蛋白；SR组为SYPRO Ruby全蛋白荧光检测法，Pre-S组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法， Pre-S+SR组为丹酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检 测，Pro-Q组为Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，Pr〇-Q+SR组为Pro-Q Emerald糖蛋白突 光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0030] 实施例1丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法
[0031] 图1是丹酰肼的化学结构式。
[0032] 图2-5是丹酰肼糖蛋白特异性荧光预染检测法数据图。
[0033] 实验采用下述步骤进行：
[0034] 1)在10 μ L含0· 5-10 μ g蛋白样品（不足10 μ L用重蒸水补足）中加入0· 03M高 碘酸水溶液10 μ L，置于避光处进行氧化反应10min ;
[0035] 2)在反应液中加入0. 24Μ抗坏血酸5 μ L，摇匀反应Imin ;
[0036] 3)在反应液中加入2%丹酰肼或其衍生物2.5111^，371：环境下反应3〇1^11 ;
[0037] 4)在反应液中加入30 μ L3X上样缓冲液，摇匀