4H-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4， 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍 的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这 些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化 对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附 等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但 目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也 占到较1?的比例。
[0003] 分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤，是下一步结构分析得以实施的基础。 目前凝胶上蛋白质染色主要分为预染及后染两类。前者在电泳前对样品进行处理，使染料 特异性地与样品内糖蛋白相结合，经电泳分离之后即可在相应激发波长下进行观察，后染 主要对电泳后的蛋白凝胶进行特异性染色。
[0004] 目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于后染，且多数产品均以高附加值的价格在 市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行 生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。糖蛋白特异性荧光预染检测 技术鲜有报道。本发明开发的4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物荧 光预染检测方法灵敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧 光预染检测技术，有较好的基础与临床意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物 在糖蛋白特异性荧光预染检测中的应用。
[0006] 本发明所述的4H-[1]_苯并吡喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼相关化合物是指以 4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。
[0007] 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核为：
[0008]
[0009] 为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻 吩-2-甲酸酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法包括如下步骤：
[0010] 1)在l-20yL含0.5-10yg蛋白样品（不足l-20yL用重蒸水补足）中加入 0. 005-0. 05M高碘酸水溶液1-20 μ L，置于避光处进行氧化反应5-30min ;优选的样品体积 为10 μ L，优选的高碘酸摩尔浓为0. 03M，体积为10 μ L，优选的反应时间是IOmin ;
[0011] 2)在反应液中加入0. 1-0. 3Μ抗坏血酸l-ΙΟμ L，摇匀反应0. 5-5min ;优选的抗坏 血酸摩尔浓度是〇. 24M，体积为5 μ L，优选的反应时间是Imin ;
[0012] 3)在反应液中加入4Η-[1]_苯并批喃[4,3_b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物按重 量体积比1-5%二甲基亚砜溶液1-5以1^，371：环境下反应1〇-5〇1^11 ;优选的4!1-[1]-苯并 吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物溶液为含重量体积是2%，体积为2. 5 μ L，优选 的反应时间是30min ;
[0013] 4)在反应液中加入10-50 μ L3X蛋白质上样缓冲液，摇匀；优选的体积为30 μ L ;
[0014] 5)电泳，观察。
[0015] 前期研究表明该技术有如下优点：
[0016] 1)灵敏度高：4Η-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光预 染检测法灵敏度同Pro-Q Emerald488灵敏度相当；
[0017] 2)操作简单迅速：省去后染必需的固定等操作步骤，可在40min内完成；电泳结束 后即可观察；
[0018] 3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
[0019] 4)可逆性好：容易脱色；
[0020] 5)质谱兼容性好：由于4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼荧光预染检 测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-T0F等质谱仪高度兼容；
[0021] 6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
[0022] 7)成本低。
【附图说明】
[0023] 图I. 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化学结构；
[0024] 图2中（A-D)为在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对Sigma公司的八种不同标准蛋 白质样品选择性及灵敏度比较。（A)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧 光预染检测法，（B)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法检 测后用SYPRORuby全蛋白荧光染色法检测，（C)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法，（D)Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。带1，1000 ng;带2， 500ng ;带 3,250ng ;带 4,125ng ;带 5,64ng ;带 6,32ng ;带 7,16ng ;带 8,8ng ;带 9,4ng ;带 10, 2ng。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法、SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记 载操作；图中名称用斜体字表示为糖基化蛋白质。
[0025] (E-H)在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对提取的人血清样品选择性及灵敏 度比较。（E)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法， (F)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白突光染色法检测，（G)Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，（H)Pro-Q Emerald糖 蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。带l，5000ng;带2,2500ng;带 3,1250ng ;带 4,625ng ;带 5, 320ng ;带 6,160ng ;带 7,80ng ;带 8,40ng ;带 9, 20ng ;带 10, 10ng。Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法、SYPRO Ruby全蛋白突光染色法均按照文献记载 操作。
[0026] 图3.二向SDS-PAGE胶上，（A) 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋 白荧光预染检测法，（B)4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测 法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。分离样品为人血清总蛋白；IPG胶条长13 厘米，PH4-7 ;分离胶的浓度为11. 4% ;样品上样量为25 μ g/胶条。
[0027] 图4.比较在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对去糖基化样品选择性，样品为用 PNGaseF去除N-链糖后的人血清总蛋白。带TP，人血清总蛋白；带DP，去N-链糖后人血清 总蛋白；Pre-S组为4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法， Pre-S+SR组为4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测 后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，Pro-Q组为Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法， Pro-Q+SR组为Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。
[0028] 图5.在一向SDS-PAGE胶上，不同方法对富集后糖基化蛋白选择性比较，样品为 使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出的糖蛋白。带TP，未富集的人血清总蛋 白；带Con A Enriched Glycoproteins,使用糖基化富集试剂盒从人血清总蛋白中富集出 的糖蛋白；SR组为SYPRO Ruby全蛋白荧光检测法，Pre-S组为4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b] 噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法，Pre-S+SR组为4H-[1]_苯并吡喃[4,3-b]噻 吩-2-甲酸酰肼糖蛋白荧光预染检测法检测后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测， Pro-Q组为Pro-Q Emerald糖蛋白突光染色法，Pr〇-Q+SR组为Pro-Q Emerald糖蛋白突光 染色法后用SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0030] 实施例1 4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光预染检 测法
[0031] 图1是4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化学结构式。
[0032] 图2-5是4H-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光预染检 测法数据图。
[0033] 实验采用下述步骤进行：
[0034] 1)在10 μ L含0· 5-10 μ g蛋白样品（不足10 μ L用重蒸水补足）中加入0· 03M高 碘酸水溶液10 μ L，置于避光处进行氧化反应10min ;
[0035] 2)在反应液中加入0. 24M抗坏血酸5 μ L，摇匀反应Imin ;
[0036] 3)在反应液中加入2% 4Η-[1]_苯并吡喃[4, 3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物 2.5以1^，371：环境下反应3〇1^11;
[0037] 4)在反应液中加入30 μ L3X上样缓冲