一种快速发现天然产物中低含量活性成分的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然产物中化合物提取分离领域，具体涉及一种快速发现复杂天然产 物中低含量活性成分的方法。 技术背景
[0002] 天然药物主要指天然来源的植物（中草药）、动物、微生物、海洋生物及其他生物 的具有明确治疗作用的单一成分或多组分药物。
[0003] 天然药物是现代创新药物发现的重要来源。许多天然来源的化合物已被发现具 有多样且独特的生理活性，在此基础上一大批具有特殊治疗作用的药物被开发出来。天然 活性物质往往具有结构新颖、活性高、不良反应少的特点，是制药工业中新药研发的重要来 源，也是我国研制具有自主知识产权的创新药物的主要源泉（参见：萧伟，陈凤龙；国内外 天然药物研究的发展现状和趋势，中草药，2009,11 :1681-1687)。
[0004] 大多数天然产物成分复杂，含量差异悬殊。生药中除了含量较高的成分以外，还含 有数量众多、含量较低的成分。这些微量成分不仅在天然药物疗效的发挥中扮演重要角色， 同时其结构和生物功能的多样性也为新药研发提供了有价值的信息。许多从天然产物中分 离得到的微量成分具有新颖的化学结构和显著的生物学活性，可作为重要的先导化合物， 有些还被直接开发成临床药物。例如，抗肿瘤药物紫杉醇和长春新碱、抗疟药物青蒿素等都 是从植物中发现的微量成分。此外，随着科研的不断深入，天然产物中高含量的活性成分已 越来越多地得到发现和研究，从新的天然资源如海洋生物和研究较少的微量天然产物中寻 找新的活性成分是天然药物研发的重要方向之一。
[0005] 然而从复杂的天然产物中发现新的微量活性成分却相当耗费时间、人力、物力却 又低效。传统的对大量复杂天然产物进行提取、分离、反复柱色谱进行纯化的方法常常导 致生药中的微量成分在多次柱色谱处理过程中损失，较难获得足够量的高纯度单体进行筛 选。为发现更多的微量成分，通常采用加大生药投料量的方式来累积微量成分，但同时也会 造成分离工作量的成倍增加和高含量成分的大量干扰，微量活性成分的发现效率依旧难以 提高。另有报道将天然产物提取物采用制备型高效液相分离，按时间分段收集馏分，并将各 馏分经脱溶剂处理后用于活性筛选。因天然药物成分众多且结构复杂多样，按时间自动化 收集的馏分往往是包含2个以上成分的混合物，经初次活性测定后，还需要对显示有活性 的馏分进一步分离纯化，制备出单体化合物，即需重复进行样品富集、分离纯化、馏分收集、 溶剂去除、样品干燥、活性测试和结构鉴定等步骤来确定活性馏分中的活性成分。更重要的 是，馏分中的微量成分很可能因达不到活性起效的浓度而被漏筛。因此，提高从天然产物中 发现微量活性化合物的效率，缩短发现时间，降低发现成本，是天然药物活性成分研究和 开发亟需解决的问题之一。
[0006] CN103487531A公开了一种适用于复杂天然产物高通量筛选的化合物库高效制备 方法，该方法能够快速、精确、自动化地制备指纹图谱中各指纹峰对应的馏分，所制备样品 纯度高，馏分不易含有共洗脱成分。但该方法由于未将复杂天然产物中的高、低含量成分区 别对待，在基于全成分色谱指纹图谱的馏分制备过程中，当高含量成分的制备量达到活性 筛选的起效浓度时，而低含量成分由于制备量较低，往往尚未达到起效浓度而难以被发现。 因此该方法不能有效地解决低含量活性成分的发现难题。
[0007] 本发明针对天然药物中的微量活性成分，在将全成分划分为高低含量成分的基础 上，结合色谱峰敲除技术和高纯度馏分制备手段，快速、自动化、选择性地富集低含量馏分， 使低含量成分达到能够进行筛选的有效浓度，从而显著提高复杂天然产物中微量活性成分 发现的灵敏度、精确度及筛选效率，有利于活性成分的快速发现。
【发明内容】
[0008] 针对天然药物中成分含量差异悬殊的情况，本发明建立了一种适合天然药物中低 含量活性成分快速发现的方法。
[0009] 本发明首先建立天然药物提取物的常规液相色谱分析方法，建立全成分色谱指纹 图谱；然后，将提取物中各成分根据其相对含量划分为高含量成分和低含量成分，基于指纹 图谱采用高分辨色谱峰馏分制备方法建立高含量成分馏分库，并对敲除高含量成分后的流 出液（包含低含量成分）进行富集、浓缩，经二次高分辨色谱峰馏分制备获得低含量馏分 库；采用串联质谱检测器同步获取高、低含量馏分库的质谱信息进行化合物鉴定；进而开 展对高、低含量馏分的活性测试和量效关系考察，实现对天然药物中微量成分的活性评价。 [0010] 该方法快速、精确、自动化程度高、操作简便、成本较低、适用性强，适用于天然产 物中微量活性成分的发现。
[0011] 本发明包括以下内容：
[0012] -种快速发现天然产物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0013] (1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相 应的提取物；
[0014] (2)采用常规液相色谱系统与自动组分收集系统联用，建立上述分析对象的全成 分色谱指纹图谱条件；
[0015] (3)高低含量成分的划分：采用面积归一化法，将各活性化合物在样品制备色谱 图中显示的峰面积，分别与各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积的总和相比， 得到各活性成分的相对含量。并将各活性成分的相对含量按照从低到高的顺序排序，选择 合适的标准将全成分划分为高含量成分和低含量成分；
[0016] (4)高含量馏分库的建立：
[0017] 运行步骤（2)中的色谱指纹图谱条件，通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束 时间以及收集位置，使组分收集系统的程序根据上述设置，自动、精确地收集各指纹峰；单 次进样直接收集高含量成分获得高含量馏分库；
[0018] 低含量馏分库的建立：
[0019] 敲除高含量成分之后对低含量成分进行富集，样品经回收溶剂后再次进样，自动、 精确收集指纹图谱中的每一个色谱峰（馏分）；
[0020] (5)采用串联质谱检测器同步获取高、低含量馏分库的质谱信息进行化合物鉴 定；
[0021] (6)对每个馏分进行脱溶剂处理，以备后续筛选。
[0022] 本发明包括以下内容：
[0023] (1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相 应的提取物。所述的提取物是采用高、中、低极性或不同酸碱性溶剂分别提取天然来源的研 究对象所得到的或经初步分离得到的混合物。
[0024] (2)采用高效液相色谱进行样品的色谱表征和优化，建立该提取物的指纹图谱。
[0025] 建立全成分指纹图谱的液相色谱的色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径 < 20mm、粒径< 5 μπι ;流速为0. 5-10mL/min，分析时间< 3h ;优选的，色谱条件可以是：分 离采用的色谱柱内径彡l〇mm、粒径彡5 μπι ;流速为1~5mL/min，分析时间彡2h ;更优选的， 色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径彡5mm、粒径彡5 μπι;流速为1~2mL/min，分析时 间彡2h。
[0026] (3)高、低含量成分的划分：具体实施方法可以根据高效液相色谱或质谱响应采 用面积归一化法、标准曲线法、内标法以及标准加入法进行定量分析。按照测量参数可以分 为峰面积法或峰高法分析化合物的含量。将化合物的含量按照从低到高排序，将全成分划 分为高含量成分和低含量成分；
[0027] (4)高含量成分馏分库的制备：运行⑵中的指纹图谱色谱分析条件，通过软件设 置高含量目标峰的起始时间和结束时间以及收集位置，使组分收集系统的程序根据上述设 置，自动、精确地收集高含量目标峰。可根据馏分的体积适当调整收集容器的大小。单次进 样收集高含量目标成分色谱峰（馏分），对每个馏分进行脱溶剂处理，获得高含量成分馏分 库。
[0028] (5)低含量成分馏分库的制备：重复数次（4)，将高含量目标峰以外的流出液，即 敲除高含量目标峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根据低含量馏分实际浓度 的需要，可选择重复2~5次或更多次，收集的混合液经脱溶剂处理后，再次进样，运行指 纹图谱色谱分析条件，对照全成分色谱图和富集后的低含量成分色谱图中每个色谱峰的出 峰顺序，对所有低含量成分色谱峰进行编号，按照上述馏分收集程序的设置方法，重新设置 低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集低含量成分指纹图谱中的每一个色谱峰（馏 分），对每个馏分进行脱溶剂处理，获得经过富集的低含量成分馏分库。
[0029] (6)对每个馏分进行脱溶剂处理：可采用氮吹、加热或真空离心干燥等方式进行 快速脱溶剂处理，以备后续筛选。
[0030] (7)液相色谱-组分收集系统同步联接质谱检测器，液相流出液在线分流后进入 质谱检测器，同时获得高、低含量色谱峰各自对应的质谱信息，对收集得到的各馏分进行纯 度检测、结构推测和成分鉴定。
[0031] (8)制备的高、低含量馏分库样品可用于多种模型的高通量筛选，因各馏分化合物 的量不一致，可设计高、中、低三个给药浓度进行给药，即将每个馏分样品不同倍数稀释成 高、中、低三个浓度分别测试，根据活性测定值并结合与浓度的关系来评判样品有无活性。
[0032] 本发明包括以下内容：
[0033] (1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相 应的提取物。所述的提取物是采用高、中、低极性或不同酸碱性溶剂分别提取天然来源的研 究对象所得到的或经初步分离得到的混合物。
[0034] (2)采用高效液相色谱进行样品的色谱表征和优化，建立该提取物的指纹图谱。
[0035] 建立全成分指纹图谱的液相色谱的色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径 < 20mm、粒径< 5 μπι