一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药成分分析检测技术领域，涉及一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类 成分指纹图谱的检测方法及其应用，具体涉及一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分 指纹图谱的检测方法及其在含量测定中应用。
【背景技术】
[0002] 银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，性甘，苦，涩，平，归心、肺经，《中药志》中记载 银杏叶能"敛肺气，平咳喘，止带池"。银杏酮酯（Ginkgo Biloba Extract，GEB50)是我国自 主研发的新一代银杏叶提取物产品，已获得原国家二类新药，并通过了美国临床预审进入 IND阶段，主要用于治疗心脑血管疾病及神经系统疾病。其中，现已获得我国国家食品药品 监督管理局批准文号的银杏酮酯的制剂共8种（银杏酮酯原料药，银杏酮酯片，银杏酮酯颗 粒，银杏酮酯胶囊，银杏酮酯分散片，银杏酮酯滴丸3种）。
[0003] 我国虽是银杏叶资源大国，但出口产品仅用于食品添加剂或保健品，故质量标准 不高。中药质量标准的提高成为中药发展的瓶颈，现代化的质量标准是提高国际竞争力的 前提。根据2015版《中国药典》，目前，银杏酮酯的质量标准检测项包括：制法、性状、鉴别、 检查（水分、炽灼残渣、重金属、黄酮苷元峰面积比、总银杏酸）、含量测定（总黄酮醇苷、萜 类内酯）、贮藏、制剂。但银杏酮酯中仍有大部分尚不清楚的成分，只测定目标成分含量并不 能真正反映其质量稳定，故指纹图谱分析、原型黄酮苷类成分的测定日益引起关注。
[0004] 中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述， 采用适当模糊处理方式，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段。其 中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检 验难以发现的质量问题。虽然银杏叶提取物的指纹图谱还未被编入《中国药典》，但银杏叶 提取物中黄酮苷元本身的含量较低，如人为添加如槲皮素等黄酮苷元，则测得的总黄酮醇 苷含量结果明显增高，表面上符合要求，实际影响药品内在质量。为保证生产原料质量稳 定；为防止生产过程中掺假、掺杂现象；为保证不同批次原料药一致性，本课题拟将银杏酮 酯指纹图谱与多成分含量测定相结合，提高现有质量标准。
【发明内容】
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银杏酮酯中黄酮类和 有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的高效液相色谱方法首次建立 了银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱，并且同时一次对银杏酮酯中多种成分进 行定量分析。本发明中方法通过指纹图谱和多成分含量测定可以比较全面的反映银杏酮酯 中黄酮类和有机酸类成分的现状，提高银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质控水平。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种银杏酮酯中黄酮类和 有机酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
[0007] 1)供试品溶液的制备：称取银杏酮酯，加入甲醇水溶液，涡旋提取后，过滤，取续 滤液，即得供试品溶液；
[0008] 优选地，所述银杏酮酯加入的重量与所述甲醇水溶液加入的体积之比为1 : 80-120(g/ml)。
[0009] 更优选地，所述银杏酮酯加入的重量与所述甲醇水溶液加入的体积之比为1 : 100 (g/ml)〇
[0010] 所述银杏酮酯和甲醇水溶液称取时，应当精密称取。
[0011] 优选地，所述涡旋提取的条件为：提取时间：3-10min ;涡旋转速：2500-3000r/ min〇
[0012] 更优选地，所述涡旋提取的条件为：提取时间：5min ;涡旋转速：2800r/min。
[0013] 所述涡旋提取是利用涡旋振荡器对样品进行的一种提取方式，通过偏心旋转使试 管等容器中的溶剂产生涡流，从而使样品与溶剂充分混合后提取样品中所需成分，该提取 方法对于一些难溶解物质也有较好溶解及提取效果。
[0014] 所述供试品溶液在密闭容器中进行涡旋提取，所述密闭容器为密闭的离心管或试 管。
[0015] 优选地，所述过滤的方式为滤膜过滤方式。更优选地，所述滤膜的孔径为0. 45 μ m。
[0016] 2)参照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得参照 品溶液；
[0017] 优选地，所述参照品溶液中芦丁的CAS号为153-18-4。
[0018] 优选地，所述参照品溶液中芦丁的浓度为200-300 μ g/ml。更优选地，所述参照品 溶液中芦丁的浓度为250 μ g/ml。
[0019] 优选地，步骤1)或步骤2)中，所述甲醇水溶液为10_90v/v%甲醇水溶液。
[0020] 更优选地，所述甲醇水溶液为10-70v/v%甲醇水溶液。
[0021] 最优选地，所述甲醇水溶液为60v/v%甲醇水溶液。
[0022] 3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱（HPLC)法分别测定供试品溶液和参 照品溶液，将获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进 行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类 成分的指纹图谱。
[0023] 优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-4(TC ;检测 波长：230-280nm ;参比波长：400-500nm ;流速：0· 5-2. Oml/min ;进样量：5-20 μ 1 ;流动相： 乙腈-0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0. 1-0. 4v/v%磷酸水溶液；分析 时间：70min ;梯度洗脱。
[0024] 更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18 柱（150mmX4. 6mm，2. 7 μπι);柱温：35°C ;检测波长：254nm ;参比波长：450nm ;流速： lml/min ;进样量：10 μ 1 ;流动相：乙腈-0. lv/v%磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为 0. lv/v%磷酸水溶液；分析时间：70min ;梯度洗脱。
[0025] 最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0026] O-lOmin，A 相：B 相体积比为 12 :88-13 :87 ;
[0027] 10-13min，A 相：B 相体积比为 13 :87-15 :85 ;
[0028] 13-20min，A 相：B 相体积比为 15 :85-16 :84 ;
[0029] 20-30min，A 相：B 相体积比为 16 :84-21 :79 ;
[0030] 30-40min，A 相：B 相体积比为 21 :79-23 :77 ;
[0031] 40-50min，A 相：B 相体积比为 23 :77-30 :70 ;
[0032] 50-70min，A 相：B 相体积比为 30 :70-75 :25。
[0033] 所述银杏酮酯的标准指纹谱图是指按照国家食品药品监督管理局2000年8月15 日颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》中的规定，取同一种至少10个批 次的银杏酮酯，分别按上述步骤1)和2)制备供试品溶液和参照品溶液，再按上述步骤3) 的HPLC条件进行测定后，分别获得指纹图谱，再将指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似 度评价软件2. 0版》，生成对照图谱，最终确定银杏酮酯的标准指纹谱图。在实际检测时，被 检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度多〇. 9,即为合格，说明获得被检样品中 银杏酮酯的指纹全谱图。
[0034] 优选地，所述供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图与银杏酮酯的标准指纹谱图进 行的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2. 0版》进行 相似度比较，以参照品溶液的指纹谱图中的芦丁色谱峰（S峰）为参比峰，根据相对保留时 间，指认出供试品溶液的指纹谱图中其它共有特征峰。
[0035] 更优选地，所述中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：时间窗：0. 15 ; 平均值法；多点校正；全谱峰匹配。
[0036] 优选地，所述供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机 酸类成分，采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS)法进行测定验证。
[0037] 更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS)法的 检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式（ESI );采集质量范围 (Mass range) :50_1200Da ;毛细管电压（Capillary Voltage) :2. 5kV ;维孔电压（Sampling Cone Voltage) :30V;离子源温度（Soure Temperature) :110-130 °C，优选为 120 °C ;去 溶剂化温度（Desolvation Temperature) :450_550°C，优选为500°C ;去溶剂化气体流量 (Desolvation Gas Flow) :75〇-850L/hr，优选为800L/hr;维孔气体流量（Cone Gas Flow): 45_55L/hr，优选为50L/hr ;校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽（Leu_enkephaline，LE);碰撞气 体：氩气；低碰撞能量通道：5eV ;高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
[0038] 更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS)法，根据 供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的共有特征峰，通过相对保留时间，确 定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。
[0039] 所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱的检测原理为：TOF-MS的质量分析 器是一个离子漂移管。样品在离子源中离子化后即被电场加速，由离子源产生的离子加速 后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞 向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOF-MS进行质量分析的判据。
[0040] 更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS)法，可与 超高效液相色谱（UPLC)相结合，通过超高效液相色谱（UPLC)分别测定供试品溶液和参照 品溶液的指纹谱图，将获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指 纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和 有机酸类成分的指纹图谱，再采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS) 法测定供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的共有特征峰，通过相对保留时 间，确定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。
[0041] 最优选地，所述超高效液相色谱法测定供试品溶液和参照品溶液指纹图谱的色谱 条件，与上述高效液相色谱法相同。但是，超高效液相色谱法的色谱条件中，使用的流动相 为乙腈-0. 1-0. 4v/v%甲酸水溶液，优选为乙腈-0. lv/v%甲酸水溶液，其中，A相为乙腈，B 相为〇. 1-0. 4v/v%甲酸水溶液，优选为0. lv/v%甲酸水溶液。
[0042] 由于电喷雾离子源