检测大麻醇的电化学纳米免疫传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物免疫检测技术领域，具体涉及一种检测大麻醇的电化学纳米免疫传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]大麻醇(Cannabinoid)是大麻(marijuana)中影响精神状态的主要成分，它对大脑的作用主要是通过激活一个叫CB1的分子受体来实现的。目前大麻醇主要用于其它药物疗效不佳的某些疾病，如神经系统疾病中的多发性硬化症(MS)、运动性神经疾病、慢性顽固性疼痛和药源性呕吐。另外，该药对青光眼、哮喘和心血管疾病也可能有一定作用，虽然尚未进入临床应用，但已引起研究者的广泛兴趣。对大麻醇的检测方法目前只能达到定性目的，如采用相应的试纸条/板/盒，灵敏度为50ng/mL。为了便于对大麻醇进行研究和应用，亟需研究发展检测灵敏度更高的检测方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对目前无法对大麻醇进行定量检测、检测灵敏度很低的缺陷，而提供一种检测大麻醇的电化学纳米免疫传感器及其制备方法和应用。本发明的电化学纳米免疫传感器不受样品的浊度、颜色的影响，无需对样品进行纯化、富集等预处理，操作简单，检测灵敏度高、特异性强，能够用于对大麻醇进行快速定量检测。
[0004]本发明提供下述技术方案解决上述技术问题。
[0005]本发明提供的技术方案之一是:一种检测大麻醇的电化学纳米免疫传感器，所述传感器以壳聚糖为桥联剂将纳米金和辣根过氧化物酶固定于电极表面，所述纳米金吸附有抗大麻醇抗体。
[0006]所述抗大麻醇抗体为本领域常规，其来源和类型均没有特殊要求，既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，优选单克隆抗体。
[0007]所述电极可以是本领域常规所述的各类电极，优选玻碳电极。
[0008]本发明提供的技术方案之二是:前述电化学纳米免疫传感器的制备方法，其包括如下步骤:
[0009](1)对电极进行预处理，然后在电极上包被壳聚糖溶液；
[0010](2)以壳聚糖为桥联剂将纳米金和辣根过氧化物酶包被在电极上；
[0011](3)继续在电极上包被抗大麻醇抗体；
[0012](4)封闭液封闭后即得。
[0013]步骤(1)为对电极进行预处理，然后在电极上包被壳聚糖溶液。
[0014]其中，所述电极可以是本领域常规所述的各类电极，优选玻碳电极。
[0015]所述壳聚糖溶液优选以如下方法制得:将壳聚糖溶于醋酸溶液得到壳聚糖溶液，备用。更优选地，将2g壳聚糖溶于100mL体积百分比为2 %的醋酸溶液中，搅拌3h得到2 %的壳聚糖溶液，备用。
[0016]步骤⑵为以壳聚糖为桥联剂将纳米金和辣根过氧化物酶包被在电极上。
[0017]如本领域常规，所述包被为将电极置于溶液中进行包被。优选地，所述包被为将电极置于由纳米金溶液和辣根过氧化物酶溶液组成的混合溶液中进行包被。
[0018]所述纳米金溶液优选以如下方法制得:取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，置于微波炉中低火保持8_10min，待自然冷却后用超纯水补充至104mL，即得纳米金溶胶，置于4°C避光保存备用。
[0019]所述辣根过氧化物酶溶液优选以如下方法制得:将辣根过氧化物酶(HRP)溶于磷酸缓冲液(PBS)中，即得辣根过氧化物酶溶液。更优选地，将0.02g辣根过氧化物酶(HRP)溶于10mL 0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，即得2.0g/L辣根过氧化物酶溶液。
[0020]所述封闭液为免疫检测领域常规的封闭液，优选牛血清白蛋白(BSA)。
[0021]所述抗大麻醇抗体为本领域常规，其来源和类型均没有特殊要求，既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，优选单克隆抗体，更优选Balb/c小鼠单克隆抗体，且纯化后抗体的浓度不低于0.5mg/mL。
[0022]在所述包被的操作过程中，如本领域常规，一般都需要经过恒温孵育和清洗的步骤。
[0023]在所述封闭的操作过程中，如本领域常规，一般也需要经过恒温孵育和清洗的步骤。
[0024]所述制备方法较佳地包括如下步骤:
[0025](1)将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为2%的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，在45°C干燥箱中干燥30min，使玻碳电极表面凝胶化；取出待冷却至室温，再浸于浓度为lmol/L的NaOH溶液中5min，用超纯水冲洗掉NaOH溶液，之后浸于超纯水中30min，彻底清除NaOH离子；取出，在25°C干燥箱干燥lOmin ；
[0026](2)将玻碳电极置于纳米金(GNPs) /辣根过氧化物酶(HRP)混合溶液中至少24h，得到GNPs/HRP电极；
[0027](3)滴加5 μ L浓度不低于0.5mg/mL的小鼠抗大麻醇单克隆抗体于制得的GNPs/HRP电极表面，30°C孵育干燥lh ;
[0028](4)超纯水冲洗三次，然后将玻碳电极置于1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液中37°C温育lh，以封闭非特异性位点；
[0029](5)以含0.05% (v/v) Tween-20的PBST溶液清洗未结合的BSA，30°C孵育干燥lh，即得用于大麻醇检测的电化学纳米免疫传感器，置于4°C PBS缓冲环境中待用。
[0030]本发明的电化学纳米免疫传感器利用循环伏安法、交流阻抗法，原子力显微镜等表征电极组装的各个阶段。利用电流时间曲线法等方法可以实现对复杂样品中大麻醇的定量检测，实验结果表明该传感器灵敏度、特异性、稳定性、重现性以及使用寿命等技术参数均良好。
[0031]本发明提供的技术方案之三是:前述电化学纳米免疫传感器的在大麻醇检测中的应用。
[0032]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0033]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0034]本发明的积极进步效果在于:
[0035]本发明的电化学纳米免疫传感器不受样品的浊度、颜色的影响，无需对样品进行纯化、富集等预处理，操作简单，检测灵敏度高、特异性强，能够用于对大麻醇进行快速定量检测，且灵敏度、特异性、稳定性、重现性以及使用寿命等技术参数均良好，具有非常好的应用前景。
【附图说明】
[0036]图1为实施例1所制备的电化学纳米免疫传感器的结构图。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。下述各实施例中，所使用的各类设备、试剂和材料若无特别说明，均为常规市售可得。
[0038]实施例1电化学纳米免疫传感器的制备
[0039]1、玻碳电极的预处理:
[0040]将玻碳电极依次分别用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m粒径的α _Α1203浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用ΗΝ0#Ρ Η 20按体积比1: 1配制的混合液、无水乙醇和超纯水清洗。在lmol/L H2S04溶液中用扫描范围为1.0?一 1.0V，扫描速度为100mV/S的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。上述稳定的循环伏安曲线满足下述要求:在实验室条件下预处理后的电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV以下，并尽可能地接近64mV，电极方能使用，最后置于氮气环境中干燥待用。
[0041]2、纳米金(Nano-Au)溶胶的制备:
[0042]根据Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入lg/100mL的梓檬酸钠溶液4mL混匀，置于微波炉中低火保持8-10min，待其自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4°C避光保存备用。利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内(400_700nm)进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长Xmax在518nm，可粗略确定纳米金平均粒径为15nm。用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征，所合成的纳米金形状规则，粒度均匀，平均粒径约为15nm，且没有聚集现象。
[0043]3、壳聚糖溶液的制备:
[0044]将2g壳聚糖溶于100mL体积百分比为2%的醋酸溶液中搅